характеристики, фото и отзывы покупателей

FRAP нержавеющий выдвижной кухонный смеситель F60899-1

Фото от продавца

Реальные отзывы с фото (20)

5 25 декабря 2019

5 04 января 2020

5 01 января 1970

5 19 января 2020

5 15 августа 2020

Заказал , быстро получил, установил — все работает отлично! Рекомендую

5 04 декабря 2019

5 22 февраля 2020

всё как в описании. достаточно высокий. еле уместился на кухне. проверяйте габариты перед заказом

5 17 июня 2020

Кран хороший, но очень большой примеряйте габариты его перед заказом. Немного люфтит поворотная муфта.

5 11 июля 2020

заказал 30.06 курьер привез 10.07 упакованно хорошо вкомплекте с ковриком для мыши за 1 копейку. удивило что винты на противовес и на фиксирующей шайба под отвёртку а в комплекте лежал шестигранник. противовес внутри оказался грязный как от ржавой воды, а внешне как новый.

5 01 декабря 2019

5 29 ноября 2019

5 22 июня 2020

Он очень большой.

4 25 июня 2020

Товар описан хорошо. Вот только качество ужасное.На второй день использования из лейки вывалились все детали.

5 27 июня 2020

Кран могли доставить за 5 дней, но я перенес срок, меня не было, по этому шел 9 дней. Коробка помялась. Коробка фирменная. Все детали в комплекте. Первично пока не разобрался как фиксируется рассекатель на носике крана. Ещё момент… кран не очень тяжёлый. Нержа не совсем привычная. Стенки тонкие. Так что на сколько его хватит, не понятно. Ещё предстоит подключить его. Брал с скидкой и каким то купоном, который вообще цену опустил до 2к. С учётом бесплатной доставки вполне себе вариант. Покупкой пока доволен. Размеры по высотам и крепежу, то что надо.

5 06 июля 2020

смеситель отличный, быстрая доставка продавца рекомендую только получил, думаю сантехник поставит смеситель на место с лёгкостью

5 09 марта 2020

товар полностью соответствует описанию. работает хорошо. в подключении прост. единственное «но»: в комплекте шла инструкция к другому крану. доставка сдеком была за дней 5. кран действительно большой. стоит это учитывать.

5 12 марта 2020

Доставка до двери. Отличный кран. Продавец отправил быстро.

Frap

Особенности

Торговая марка Frap появилась на российском рынке уже более 15 лет назад. Используя новейшие разработки в сфере сантехнических аксессуаров, китайский производитель наладил выпуск широкого ассортимента продукции. В продаже сегодня можно найти аксессуары для ванных комнат (ершики, мыльницы, крючки, светильники и прочее), смесители, душевые системы, мойки, зеркала и раковины. Ощутимым плюсом компании Frap является производство всевозможных комплектующих для сантехники и даже шторок для душа.

Несмотря на то что страна-производитель данной продукции – Китай, все товары выполнены достаточно качественно и даже стильно. Особенностью сантехнических изделий этого бренда является наличие как бюджетных вариантов смесителей, так и более дорогостоящих – люксовых – моделей.

Продукция китайского производителя обладает всеми необходимыми сертификатами качества и экологичности:

• общеевропейский стандарт CE;
• американский UL;
• международные ISO 9001 (качество) и ISO 14001 (экология).

Производитель настаивает на том, что в основе производства лежат немецкие технологии и качество. Но как же тогда продукция может иметь такую экономичную цену – объясняется просто. Немецкая компания Grohe продала китайцам свою лицензию на производство аналогов моделей, которые для немцев уже считаются устаревшими, но не менее качественными.

Об основных положительных и отрицательных сторонах сантехнических смесителей речь пойдет далее.

Что представляют собой компания Frap и ее смесители

Эта продукция относится к бюджетной категории. Самые дорогие люкс-модели в линейке компании соизмеримы по стоимости со средними смесителями европейских производителей. Сантехника китайская, но фабричная.

Поэтому менеджеры в специализированном магазине скажут вам, что она гораздо надежнее, чем китайские товары кустарного производства.

Производитель также выпускает сантехнику под торговыми марками-сателлитами Ledeme и Gappo.

Производитель обеспечивает сервисную поддержку, обслуживание и ремонт в течение гарантийного срока.

Судя по текстовым отзывам на одной из ведущих мировых торговых интернет-площадок AliExpress, продукцию Frap покупают и в США, и в Европе. Подавляющее большинство людей, заказавших смесители этого бренда, живут в России.

По большей части компания делает смесители, похожие на модели известных брендов. Оригинальных приборов в линейке компании немного. Потребители утверждают, что изделия привлекают современным внешним видом и возможностью подобрать модель под стиль комнаты. Ключевое же качество смесителей Frap, на котором делают акцент маркетологи компании, — экономичность. Она заключается в:

1. Европейских стандартах экономии воды.
2. Сбережения ваших денег. Продукция похожа по своим качествам на дорогую, но стоит дешевле.

Внимание! Низкая стоимость чаще всего означает использование менее качественных материалов и технологии. Frap объясняет её главным образом оптимизированным процессом производства, а также говорит о низкой себестоимости сырья

Например, вместо нержавеющей стали основная линейка смесителей изготавливается из латуни и бюджетных сплавов.

Варианты для ванной комнаты с душем

Смесители для душа «Фрап» оснащаются дополнительным отводом, который позволяет подключить душевой шланг. Благодаря этому существует два режима подачи воды: на излив или душ. К данной группе можно отнести A63-6 G3263-6, A65 G3265, 12 G3012. Для установки на стену подойдет модель H51 F3051. Она оснащается термостатическим устройством, регулирующим температуру воды. Покупатели отмечают, что в течение 1 года эксплуатации проблемы обычно не возникают. Они появляются по истечении этого срока. Наиболее распространенная проблема, если судить по отзывам, заключается в неисправности самого датчика.

Во многих случаях пользоваться смесителем можно только при установке минимальной температуры. Практически все пользователи отмечают постукивания при перепадах давления в водопроводе или наличии воздушного пузыря.

Популярные модели

Классическое разделение вариантов китайских смесителей выглядит следующим образом:

• для кухни;
• для ванной.

В первой категории моделей к популярным можно отнести варианты: F4909 и F4927. Это классические двухвентильные смесители с хромированным покрытием. Высокий излив идеально подходит для раковины на кухне. Варианты снабжены стандартным аэратором. Вид изделия имеют классический.

Среди изделий современного типа популярен вариант для умывальника F10703-B. Это однорычажная модель, без маховиков, компактная. Она будет уютно выглядеть как в ванной комнате, так и на кухне. Специалисты рекомендуют выбирать ее для ванной, так как для кухни она может оказаться низкой.

Высокой популярностью пользуются смесители сенсорного типа F512-1 и F511. Модели оснащены термостатом, имеют традиционную форму излива, идеальны для умывальника

Излив привлекает внимание хромированным покрытием. Сенсор инфракрасного типа питается как от сети, так и дополнительно от батареек

Цена на устройство довольно демократичная, так как поворотного механизма в нем нет, встроенный фильтр отсутствует, обратного клапана нет. Ассортимент разнообразен цветовыми решениями.

В продаже можно найти модели в следующих цветовых исполнениях:

• белый;
• черный;
• песочный;
• полированный;
• матовый.

Если в санузел нужны более привычные варианты с оснащением в виде стандартного поворотного механизма, то лучше рассмотреть модели G2245 и F3014. Дополнительный поворотный механизм позволяет переключать воду с крана на душ. Этот механизм удобен для регулировки одной рукой. При выборе вариантов стоит иметь в виду, что даже самые дорогие и качественные модели не будут работать при неправильной установке и несоблюдении инструкций по эксплуатации.

Смесители для ванной

Выбирая однорычажный смеситель «Фрап» для ванны можно обратить внимание на такую модель, как H51 F1051. Это термостатический вариант, который исключит вероятность ожога во время купания (это особенно актуально при купании детей)

Сенсорный смеситель «Фрап» также подойдет для установки в ванной комнате на умывальник (необходимо наличие только 1 отверстия). Модель G516 обладает панелью LED, которая включается от легкого касания. Выбранный режим отображается на панели.

Еще один вариант смесителя «Фрап» для ванной – сенсорная модель F511-1 с термостатом. Покупатели отмечают некоторые неточности при сборке (к примеру, разные зазоры между датчиком и корпусом), самостоятельное выключение и включение. Может работать от розетки или от батареек («пальчиковых»).

Варианты для ванной комнаты с душем

Смесители для душа «Фрап» оснащаются дополнительным отводом, который позволяет подключить душевой шланг. Благодаря этому существует два режима подачи воды: на излив или душ. К данной группе можно отнести A63-6 G3263-6, A65 G3265, 12 G3012. Для установки на стену подойдет модель H51 F3051.

Она оснащается термостатическим устройством, регулирующим температуру воды. Покупатели отмечают, что в течение 1 года эксплуатации проблемы обычно не возникают. Они появляются по истечении этого срока. Наиболее распространенная проблема, если судить по отзывам, заключается в неисправности самого датчика.

Это приводит к тому, что температура воды не регулируется.

Во многих случаях пользоваться смесителем можно только при установке минимальной температуры. Практически все пользователи отмечают постукивания при перепадах давления в водопроводе или наличии воздушного пузыря.

Модели для кухни

В каталоге компании имеется большое количество вариантов смесителей для кухонных моек, которые отличаются своими характеристиками.

Смеситель «Фрап F4321-5» является одним из наиболее популярных вариантов у покупателей. Это однорычажная модель с поворотным изливом и горизонтальным монтажом. Пользователи остаются довольны своим выбором. Чаще всего устанавливают смеситель как дополнительный кран для питьевой воды.

Еще один интересный вариант – F1074-2. Это однорычажная модель, которая может устанавливаться и на мойку, и на столешницу. Отличается высокой «ножкой».

Поворотную конструкцию излива имеют также такие модели, как A65 G4065, F4008.

Среди вариантов с двумя вентилями и высоким изливом можно выделить G4012. Он работает за счет керамического картриджа. Сюда же можно отнести 11 G4011, 15 G4015.

Для кухни обычно приобретают смесители с высоким изгибом. Благодаря этому воду набирать можно даже в высокую емкость, а мыть посуду гораздо удобнее. Прекрасно подходят для кухни приборы гибкие и выдвижные.

Смесители для ванной

Выбирая однорычажный смеситель «Фрап» для ванны можно обратить внимание на такую модель, как H51 F1051. Это термостатический вариант, который исключит вероятность ожога во время купания (это особенно актуально при купании детей)

Сенсорный смеситель «Фрап» также подойдет для установки в ванной комнате на умывальник (необходимо наличие только 1 отверстия). Модель G516 обладает панелью LED, которая включается от легкого касания. Выбранный режим отображается на панели.

Еще один вариант смесителя «Фрап» для ванной – сенсорная модель F511-1 с термостатом. Покупатели отмечают некоторые неточности при сборке (к примеру, разные зазоры между датчиком и корпусом), самостоятельное выключение и включение. Может работать от розетки или от батареек («пальчиковых»).

Ассортимент смесителей Frap

Компания производит смесители для разных нужд. Наиболее популярна в модельном ряду продукция категории люкс.

Характерная особенность её конструкции – высокий «носик», что сделано для удобства и внешнего эстетизма. Люкс-модели делают из латуни с помощью гальванизации, а затем покрывают хромом.

Это позволяет предложить покупателю разные цвета товара, чтобы соответствовать дизайну конкретной комнаты:

• черный;
• белый;
• матовый;
• песочный;
• полированный.

Совет. Среди потребителей наибольшей популярностью пользуются одно- и двухрычажные смесители. Специалисты также рекомендуют их как самые простые.

Люксовая серия Frap носит имя Gappo или просто Frap G. Модели, в неё входящие, сделаны по лицензии мирового лидера в производстве сантехники – немецкой компании Grohe. Фактически, это те смесители, которые немцы сняли с производства как слегка устаревшие в дизайне. Именно бренд Gappo среди всей линейки смесителей и другой продукции компании Frap рекомендуют сантехники.

Эконом-класс смесителей Frap обычно изготавливают из бюджетного металлического сплава – силумина. Однако по отзывам потребителей, очень часто корпус модели лопается после недолгого времени работы.

Специалисты рекомендуют с осторожностью относиться к покупке самых дешевых смесителей: никто не застрахует вас от поломки через 1,5 мес., хотя кран может проработать и несколько лет. Совет

Чтобы поменять смеситель по гарантии, устанавливайте его аккуратно. Гайки закручивайте без использования гаечного ключа. В процессе эксплуатации во время гарантийного срока пользуйтесь краном бережно

Совет. Чтобы поменять смеситель по гарантии, устанавливайте его аккуратно. Гайки закручивайте без использования гаечного ключа. В процессе эксплуатации во время гарантийного срока пользуйтесь краном бережно.

Ремонт

Некоторые модели китайского производителя настолько просты, что их легко отремонтировать. Например, однорычажные варианты с картриджем не подвергаются ржавчине, не боятся негативного действия. Преждевременное разрушение этих устройств может возникнуть из-за воды плохого качества. Чтобы лучше понять процесс ремонта, стоит разобрать устройство на составляющие запчасти, желательно своими руками.

Каждый смеситель этого вида обязательно включает следующие детали:

• рычаг, которым регулируется вода;
• регулировочный штырь, на который закрепляется рычажок;
• корпус с шарниром внутри; вместо клапана может присутствовать картридж из пластика с керамическими внутренностями;
• кольцо;
• регулировочная манжета;
• дивертор.

Частой причиной выхода из строя керамических картриджей может служить мелкий сор, попавший в водопроводную систему. Если в качестве основной детали, распределяющей воду, выступает стальной шар, то он со временем может заржаветь. Для нормальной работы устройства часто достаточно произвести замену изношенных деталей.

Иногда течь в кране может образоваться из-за деформации резиновых уплотнителей. Эта поломка может возникнуть из-за плохо затянутой прижимной гайки. Протекание можно быстро устранить при помощи герметика. Это средство поможет справиться с проблемой временно, если купить новое изделие не представляется возможным.

Чтобы отремонтировать внутренние части смесителя, для начала его нужно снять. Фиксирующий винт можно найти под декоративной заглушкой, на которой обычно расположены точки горячее и холодное. При откручивании винта стоит снять сам рычаг. Здесь требуется предельная аккуратность, иначе конструкция легко повреждается. При снятии рычага откроется еще одна декоративная деталь, а под ней расположена прижимная гайка.

Далее, действия будут отличаться от внутренностей смесителя – распределительный шар или картридж. В первом варианте стоит проверить общий вид самого шара, состояние резинок и удерживающих пружин. Каждый из этих элементов можно заменить новыми по отдельности.

Особенности

Кроме смесителей, производитель Frap предлагает потребителю недорогую, но качественную сантехнику, детали для соединения труб, а также полезные аксессуары для ванной комнаты. Сантехника этой торговой марки известна широкой публике под названиями Ledeme и Gappo.

Оригинальных изделий собственной линейки компания предлагает немного. Внешний вид устройств современный. Китайский производитель предлагает большое количество вариантов стилизованного оформления изделий. Главное же преимущество приборов – это экономичность. Это качество проявляется в возможности экономии как на самых смесителях, так и на расходе воды.

Кстати, маркетологи, работающие с китайскими устройствами, говорят, что низкая стоимость обуславливается оптимизацией производственных процессов, а не низкой себестоимостью используемых материалов. Хотя если рассматривать самые дешевые изделия фирмы, то используемые сплавы в изделиях действительно бюджетные. Нержавеющая сталь в этих устройствах не присутствует. В производственных процессах чаще участвует латунь с оптимально подходящими недорогими сплавами. Название используемой в производстве основы для сплавов – это силумин.

Ремонт

Прежде чем приступать к ремонту смесителя своими руками, необходимо разобраться в первопричине проблемы. Одной из самых распространенных неувязок в работе конструкций Frap является износ керамического картриджа изделия. Из-за этого может возникать течь.

Поэтапная инструкция по замене картриджа в однорычажной модели предполагает, что вам необходимо разобрать смеситель Frap.

• Перекрыть подачу воды в кран.
• Снять ручку, открутив винтик шестигранным воротком на 2,5.
• Открутить полусферу. Если кран используется давно, здесь может возникнуть проблема: «прикипание» ручки к телу смесителя. На помощь приходит обычный столовый уксус. Обрабатываем место «прироста», снимаем ручку.
• Открутить гайку картриджа при помощи ключа. Вынуть картридж.
• Привести в порядок место, где находился «провинившийся»: очистить от налета и, возможно, ржавчины.
• Вставить новый картридж, и закрутить все детали в обратном порядке.
• Подключить воду и запустить систему.

Конечно, никто не застрахован от неполадок и сбоев в работе смесителей. Однако все они решаются самостоятельно, без обращения к сантехникам. А полный спектр комплектующих, производящихся на том же заводе, приятно радуют как новичков, так и профессионалов сантехнического дела.

Наиболее востребованные модели

Итак, победителями в категории «для кухни» становятся F4909 и F4927. Это – хромированные двухвентильные смесители с высоким изливом, одним стандартным аэратором. Классические модели.

Следующим чемпионом по праву становится кран для умывальника F10703-B. Современная однорычажная низкая модель очень компактно и уютно смотрится как в кухне, так и в ванной.

G2245 и F3014-B – привычные стандартные смесители для ванны. Первый оснащен поворотным механизмом переключения на душ и двумя вентилями. Второй обеспечивает нажимное переключение и имеет всего лишь один рычаг, позволяющий включать, выключать и регулировать воду одной рукой.

В последнее время торговая марка Frap активно внедряет в свое производство европейские технологии и дизайн. Так, благодаря наследованию известных брендов в ассортименте китайского производителя появились дизайнерские новинки, которые радуют не только своим внешним видом и сходством с прославленными брендами.

Типы выпускаемых моделей

Смесители Frap производятся нескольких типов:

Классические варианты с двумя вентилями. Они прекрасно подойдут для тех, кто отдает предпочтение традициям. Напор и температура воды регулируется с помощью двух кранов. Один из них отвечает за холодную воду, другой – за горячую. От предыдущих поколений модели отличаются тем, что вентили заменены буксами, способными поворачиваться лишь на пол-оборота. В эту категорию входят такие модели, как G4012 для мойки, G2212 с креплением на стену, F2077 с интересной формой вентилей и многие другие.

• Смесители с джойстиком. Напор изменяется при движении рычага вверх или вниз. А температура – при повороте рычага влево или вправо. Как утверждают отзывы, смесители «Фрап» данного вида очень удобны в эксплуатации. Они позволяют регулировать поток воды одной рукой. Примерами могут служить смесители G1014 для раковины, G4001 из коллекции «Аванда», настенная модель G2208.
• Сенсорные смесители являются лидерами по комфорту использования. Имеется сенсорный датчик, благодаря которому настраивается желаемая температура и мощность потока. Из представителей данной группы можно назвать G516.
• С термостатическими датчиками. Данный смеситель способен поддерживать заданное значение температуры независимо от температуры воды в водопроводе или изменения напора. Ярким примером можно считать модель F3051 с латунным корпусом и лейкой.

Как можно судить из отзывов о смесителях «Фрап», покупатели чаще всего отдают предпочтение однорычажным моделям. Пользоваться ними гораздо легче, чем, к примеру, двухрычажными. С сенсорными моделями зачастую во время эксплуатации возникают проблемы. Да и варианты с термодатчиками далеко не всегда радуют своих пользователей.

Плюсы и минусы

Среди неоспоримых плюсов смесителей данного производителя стоит выделить некоторые основные свойства.

• Экономичная стоимость и не страдающее от этого качество.
• Использование экологически чистых сырья и технологии производства.
• Большое разнообразие форм, размеров, цветов, способ монтажа.
• Наличие функциональных опций. Например, смеситель с гибким изливом для кухни. Смеситель для ванны, способный выдержать максимальное давление – напор воды.
• Керамический картридж.

И хотя последний пункт можно отнести как к плюсам, так и к минусам, лучше уж оставить его на рубеже этих двух крайностей. Говоря же о недостатках смесителей, можно заметить наличие незначительного количества бракованных позиций, определить которые лучше воочию, не прибегая к онлайн-покупкам. Но также на сегодняшний день существует большое количество подделок этой фирмы, которые не стесняются ставить еще ниже стоимость и продавать откровенно некачественные вещи.

Разновидности

Все смесители китайского производителя можно поделить на несколько категорий, о которых далее пойдет речь более подробно. По функциональному предназначению они делятся на несколько разновидностей.

• Для кухни. Место для приготовления и приема пищи должно быть на высоте, чтобы там хотелось находиться и творить кулинарные шедевры для себя и своей семьи. Если в доме нет посудомоечной машины, то на вашу кухню отлично подойдут смесители с длинным изливом, иногда с гибким шлангом – душем. Такой вид кранов помогает не только помыть посуду и продукты. В некоторые модели встроены два аэратора, один из которых подключается к центральному водоснабжению, а второй может выступать в качестве крана отфильтрованной воды.
• Для раковины. Любителям минимализма и желающим просто поставить на кухне мойку с небольшим краном, подойдут модели невысоких смесителей. Frap представляет в этой категории сенсорные краны, изделия с рычагом (для изменения теплоты воды и напора), вентильные, термостатические и кнопочные.

• Для ванны зачастую используются смесители с нижним изливом, который позволяет беспрепятственно и без потерь набрать душистую ванну и полежать в ней с удовольствием. Но также имеются модели с термостатичными свойствами. Таким образом, можно не переживать за перепады температуры воды в системе. Особенно это касается семей с детьми. Благодаря такому новшеству китайской компании, страх за внезапную подачу кипятка из крана отходит.
• Для душа. Здесь производитель делает акцент на смесители без излива.

Что касается функциональной направленности каждой модели, то она очевидна, практична и актуальна. По внешнему же виду можно разделить продукцию Frap на три вида: стандарт, ретро и модерн. Стандартные модели производятся в соответствии с имеющимися мировыми стандартами, без изысков и фантазии. Изготовлены они зачастую из латуни, силумина и алюминия. Среди ретромоделей можно встретить смесители под бронзу, с изысканными и утонченными формами. Категория модерн же позволяет внести в жизнь капельку разнообразия, предлагая самую разнообразную цветовую гамму: черный, белый, оранжевый, зеленый, бежевый, серый и коричневый.

Силиконовые модели встречаются очень часто в сочетании с высоким изливом, также радуют глаз обширной палитрой. А уникальный смеситель-водопад имеет каскадный спуск воды. Чаша его обычно изготовлена из стекла.

У современных российских покупателей уже наметились даже свои любимчики среди смесителей компании Frap. О них речь пойдет ниже.

Установка

Зачастую смесители Frap достаточно просты в установке

Однако есть несколько нюансов, на которые стоит обратить внимание еще на этапе приобретения

По типу монтажа краны делятся на три основные группы.

1. Встраиваемые. Такие модели обычно крепятся непосредственно на ванну, тумбу или раковину. Используются в комнатах, где все канализационные и водопроводные трубы скрыты от глаз.
2. Центральные. Установка происходит в вертикальном положении на раковинах и мойках. Чаще всего это модели, имеющие высокий излив, реже – с низким.
3. Настенные. Смесители этой группы устанавливаются на водопроводные трубы, находящиеся непосредственно на стене помещения. Наиболее распространены в ванных комнатах.

Монтаж последних производится максимально просто и быстро. Как правило, они устанавливаются на два отверстия. В первую очередь в водопроводные трубы монтируются эксцентрики. Следующим этапом идет накрутка отражателей. Сделать это необходимо максимально, чтобы они были очень близко к стене или к трубе. Следующим шагом будет изоляция эксцентриков, чтобы они не протекали в процессе эксплуатации. Чаще всего для этого используется льняная нитка или ФУМ-лента. Финал – установка смесителя непосредственно

Очень важно не перетянуть накрутки всех комплектующих. Несмотря на качество материалов и производства, есть риск сорвать резьбу или вовсе получить трещину

Frap Н701 — смесители из Китая

3DPLITKA.RU

Пн-Пт 9:00–20:00

Сб-Вс 10:00–20:00

16-я Парковая д.23

г. Москва, индекс 105484

Принимаем к оплате:

Мы в соц.сетях:

Мы в Яндекс.Организации:

Мы на Яндекс.Маркете:

Москва +7 (495) 966-18-01

Санкт-Петербург +7 (812) 309-35-78

Воронеж +7 (473) 202-47-57

Екатеринбург +7 (343) 289-18-98

Нижний Новгород +7 (831) 281-52-53

Новосибирск +7 (383) 284-08-48

Казань +7 (843) 211-02-57

Краснодар +7 (861) 201-25-33

Красноярск +7 (391) 216-76-03

Пермь +7 (342) 207-98-33

Ростов-на-Дону +7 (863) 310-02-03

Самара +7 (846) 375-94-33

Саратов +7 (8452) 39-79-54

Тверь +7 (4822) 73-65-21

Томск +7 (3822) 99-43-77

Тула +7 (4872) 52-41-06

Тюмень +7 (3452) 39-72-57

Уфа +7 (347) 225-06-33

Челябинск +7 (351) 220-14-23

Другой регион +7 (800) 301-34-28

Ⓒ 2011-2021 3dplitka.ru — интернет-магазин керамической плитки, керамогранита и сантехники

Политика организации в отношении обработки персональных данных

Используя этот сайт вы даёте своё согласие на использование файлов cookie

Кухонный смеситель с гибким краном от Frap (модель F4353)

границ | Планарные поддерживаемые мембраны с мобильными белками SNARE и количественная флуоресцентная микроскопия для исследования слияния синаптических пузырьков

Введение

Высвобождение нейротрансмиттера в синапсе, осуществляемое путем слияния синаптических везикул с пресинаптической мембраной, представляет собой быстрый и высоко регулируемый процесс, зависимый от Ca ²⁺ , который катализируется нейронными SNAREs синаптобревин-2 (Syb2, VAMP-2), SNAP-25 и синтаксин-1a (Syx1a; Jahn and Scheller, 2006; Jahn and Fasshauer, 2012; Rothman, 2014).Несмотря на огромный прогресс в этой области, нам все еще не хватает молекулярной временной шкалы, которая идет от стыковки синаптических везикул с плазматической мембраной, через запуск механизма слияния и, в конечном итоге, до слияния двух мембран, когда потенциал действия достигает синаптического конца ( Ян и Фассауэр, 2012; Зюдхоф, 2013). В дополнение к SNAREs, лежащим в основе механизма слияния, были идентифицированы и охарактеризованы несколько белковых игроков, которые регулируют процесс слияния. Munc18, растворимый белок 68 кДа, необходим для слияния (Hata et al., 1993; Verhage et al., 2000) и было предложено организовать SNAREs внутри более крупного акцепторного комплекса (Ma et al., 2013; Baker et al., 2015). Munc13, белок 196 кДа, связан с праймингом синаптических везикул (Ma et al., 2013), в то время как комплексин (Cpx), спиральный белок 15 кДа, был идентифицирован как ингибитор спонтанного, то есть Ca ²⁺ независимое, слияние пузырьков (Yang et al., 2010), а также способствует быстрому синхронизированному слиянию (Xue et al., 2007; Maximov et al., 2009).Synaptotagmin 1 (Syt1), мембранный белок 47 кДа, состоящий из двух мембранных связывающих доменов C2, был идентифицирован как датчик Ca ²⁺ для быстрого синхронизированного высвобождения в нейронах гиппокампа (Perin et al., 1990, 1991; Maximov and Südhof , 2005). Точная роль этих белков и природа событий, которые составляют промежуточные звенья механизма слияния во время стыковки, прайминга и начала слияния, очень обсуждаются. Хотя важность вышеуказанных белков можно оценить с помощью новаторских экспериментов in vitro, и in vivo, , роль липидов и их взаимодействия с белками не были исследованы сравнимо подробно.Рекомбинантный белок в сочетании с модельными мембранами был важным инструментом для исследования слияния мембран in vitro . Начиная с первоначального анализа слияния липосом, опосредованного SNARE, введенного Weber et al. (1998) и Ротман (2014), которые помогли сформулировать текущую версию «гипотезы SNARE», эксперименты по восстановлению, которые пытаются измерить саму реакцию слияния, получили много внимания. Однако, чтобы проанализировать молекулярные детали этапов стыковки, праймирования и слияния, необходимо картировать и количественно контролировать лежащие в основе сродства и концентрационные зависимости между подмножествами соответствующих белков и липидов, а также их сложные взаимодействия.Один из путей, который мы выбрали в последние годы, — использовать методы флуоресцентной микроскопии в сочетании с плоскими поддерживаемыми мембранами (Tamm, 1984; Tamm and McConnell, 1985). Плоская геометрия образца позволяет применять сложные методы флуоресцентной микроскопии для исследования динамики, структуры и функции липидов и белков внутри липидного бислоя (Tamm and Kalb, 1993). Начиная с необходимых образцов и подготовки, мы опишем флуоресцентные анализы, которые мы разработали и применили для решения некоторых загадочных вопросов, связанных с механизмом слияния синаптических везикул.

Подготовка проб

Хотя подробное обсуждение этой темы выходит за рамки данного обзора, мы хотим выделить некоторые характеристики методов подготовки образцов, которые, как мы обнаружили, были наиболее важными для значимых приложений.

Поддерживаемые мембраны

Существует два принципиально разных метода формирования поддерживаемого липидного бислоя: прямое слияние везикул и комбинированный метод переноса Ленгмюра-Блоджетт / слияния везикул (LB / VF) (Tamm, 1984; Kalb et al., 1992). Возможно, из-за его простоты большинство исследовательских групп использовали метод прямого слияния везикул. Однако интегральные мембранные белки в этом типе бислоев обычно не подвижны в латеральном направлении, и слияние мембран, наблюдаемое в этой системе, часто не воспроизводит физиологические или другие анализы in vitro (Bowen et al., 2004; Fix et al., 2004; Лю и др., 2005). В методе LB / VF сначала липидный монослой переносится с поверхности раздела воздух-вода в лотке Ленгмюра на чистый субстрат, а затем липосомы, которые могут содержать белок, слитый с этим поддерживаемым монослоем, с образованием второго листка последнего бислоя ( Рисунок 1А).Два свойства полученной поддерживаемой мембраны важны для анализов, обсуждаемых ниже. Во-первых, восстановленные белки SNARE высоко ориентированы с их цитозольным доменом, обращенным от субстрата (рис. 1B). Следовательно, они очень подвижны в плоскости бислоя даже при относительно высоком соотношении белков и липидов (Wagner and Tamm, 2001; Kiessling and Tamm, 2003; Liang et al., 2013). Во-вторых, двухэтапные процедуры подготовки позволяют собирать асимметричные липидные бислои (Crane et al., 2005; Kiessling et al., 2006). Метод LB / VF также может быть использован для введения полимерной подушки между субстратом и поддерживаемой мембраной для увеличения подвижности крупных мембранных белков (Wagner and Tamm, 2000). Важно отметить, что для SNAREs с их небольшим C-концевым доменом этот полимер не требуется (Wagner and Tamm, 2001; Domanska et al., 2009). Для подробного обсуждения препарата поддерживаемых мембран и его преимуществ см. Также два недавних обзора (Kiessling et al., 2015a, b).

Рис. 1. Подготовка образца и требования к поддерживаемой мембране — приложения SNARE. (A) Восстановление трансмембранных белков в поддерживаемые мембраны выполняется с помощью двухэтапной техники. На этапе i липидный монослой переносится с поверхности раздела вода-воздух в желобе Ленгмюра-Блоджетт на соответствующий гидрофильный субстрат. На этапе ii липосомы, содержащие белок, сливаются с монослоем в проточной камере, чтобы собрать второй листок поддерживаемого бислоя и включить мембранные белки. (B) Синтаксин-1a (Syx1a), восстановленный с помощью техники, изображенной на (A). ориентирован так, что его мотив SNARE обращен в сторону от подложки. Инкубация меченого Syx1a (Alexa 546 по остатку 192) с Co ²⁺ приводит к ~ 90% тушению флуоресценции, в то время как такое же применение с симметрично распределенным липидом, меченным родамином, приводит к ~ 50% тушению флуоресценции (Liang et al., 2013) . (C, D) Образование 1: 1 комплекса Syx1a: SNAP-25 в DPC, как продемонстрировано с помощью ионообменной хроматографии и SDS-PAGE.Равные молярные количества Syx1a и SNAP25 смешивают и инкубируют в течение ночи в DPC перед ионообменной очисткой. (C) Профиль элюирования MonoQ: синяя кривая показывает УФ-поглощение (левая ось), а красная кривая показывает проводимость элюированного буфера (правая ось). Красные вертикальные линии внизу обозначают собранные фракции, а фракции, полученные на гелях SDS-PAGE, помечены соответствующими заглавными буквами. (D) SDS-PAGE образцов белка, очищенных с помощью колоночной хроматографии MonoQ.Поскольку молекулярная масса SNAP-25 примерно в два раза больше молекулярной массы синтаксина (остатки 183–288), полоса SNAP-25 в два раза сильнее полосы Syx1a, когда они находятся в молярном соотношении 1: 1 (Kreutzberger et al., 2016 ). (A) перепечатано из Kiessling et al. (2015a) с разрешения Elsevier. (C, D) перепечатаны из Kreutzberger et al. (2016) с разрешения Elsevier.

Мембранные белки

И Syb2, и Syx1a являются интегральными мембранными белками, которые прикреплены к везикулам или мембранам-мишеням, соответственно, через единственную С-концевую трансмембранную спираль.Оба белка склонны к агрегации в мембранах, особенно Syx1a. Эффект кластеризации Syx1a в мембране был широко исследован, и его биологическое значение было горячо обсуждаемой темой (van den Bogaart et al., 2013). Хотя Syx1a обычно очищают с помощью различных типов детергентов, включая октил-бета-глюкозид, холат или CHAPS, мы недавно обнаружили, что додецилфосфохолин (DPC) может обеспечивать мономерную форму Syx1a (Liang et al., 2013). Кроме того, используя DPC во время сборки акцепторного комплекса Syx1a: SNAP-25, мы можем получить этот комплекс в строгой стехиометрии 1: 1, что приводит к высокоактивному акцепторному комплексу SNARE (рисунки 1C, D; Kreutzberger et al. al., 2016).

Nascent SNAP-25 представляет собой растворимый белок, который становится посттрансляционно модифицированным, и белок периферической мембраны путем пальмитоилирования четырех цистеинов в линкерной области между двумя мотивами SNARE. Ранее в большинстве исследований слияния in vitro и SNARE использовалась растворимая форма SNAP-25. Мы сконструировали четырехкратно додецилированный SNAP-25 посредством дисульфидного связывания предшественника додецилметантиосульфоната с четырьмя природными цистеинами SNAP-25. Эта ассоциированная с мембраной форма SNAP-25 может использоваться для образования высокоактивного целевого акцепторного комплекса SNARE в липосомальных или поддерживаемых мембранах, который обеспечивает быстрое и эффективное слияние с Syb2-содержащими протеолипосомами (Kreutzberger et al., 2016).

Для некоторых описанных здесь флуоресцентных анализов мечение мембранных белков флуорофором является важным аспектом подготовки образцов. Хотя слияние мембран можно наблюдать с помощью липидов и / или меток содержимого, мечение самих белков дает уникальную информацию, такую ​​как белок-белковое взаимодействие с помощью FRET или ориентация мембранных белков с помощью интерференционного контраста флуоресценции (FLIC). Мечение белков может быть достигнуто путем генетического добавления гибридного белка, такого как GFP, к N- или C-концу.В последнее время тиол-реактивные флуорофоры приобрели большую популярность из-за их небольших размеров, высокого квантового выхода, фотостабильности, множества вариантов окраски и сайт-специфичности благодаря относительно легкому введению единичных мутаций цистеина. Эффективность маркировки этой реакции обычно приближается к единице, если образцы обрабатываются в бескислородной среде. Мы обычно помечаем мембранные белки перед удалением их меток очистки. Меченые образцы затем повторно связываются с аффинной средой и подвергаются интенсивной промывке для удаления непрореагировавших свободных меток (Liang et al., 2013).

Измерение взаимодействий внутри мембран с помощью восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) и отслеживания отдельных частиц (SPT)

Как липидный состав мембран взаимодействует с содержанием в них белка? Это, вероятно, центральный вопрос для определения того, что приводит к слиянию мембран во время экзоцитоза. Систематические измерения диффузионного поведения липидов и белков в мембранах — это один из методов, который может прояснить некоторые из этих критических взаимодействий.

Диффузия интегральных мембранных белков

Наблюдение за восстановлением флуоресцентного содержимого в определенной области мембраны, которая была полностью или частично лишена флуоресценции, путем применения мощного лазерного импульса является стандартным методом исследования механизмов переноса или диффузии в биологических и модельных мембранах. Плоская геометрия поддерживаемых мембран делает их особенно подходящими для структурированного восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP; рис. 2A), простой в применении и анализе версии FRAP, которая позволяет определять подвижные фракции и коэффициенты диффузии (Smith and McConnell, 1978 ; Тамм, Калб, 1993).

Рис. 2. Поддерживаемые мембранные методы флуоресцентной микроскопии. (A) Восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) регистрирует восстановление флуоресценции из-за боковой диффузии в интересующей области мембраны после применения мощного лазерного импульса. Общая интенсивность области регистрируется до и после применения отбеливающего импульса (Smith and McConnell, 1978). Примерный график справа показывает восстановление меченных Alexa488 t-SNARE в поддерживаемых мембранах (Wagner and Tamm, 2001). (B) Отслеживание отдельных частиц (SPT). Движение компонентов мембраны, помеченных одним флуорофором, отслеживается в плоскости x / y липидного бислоя. Статистический анализ траекторий может количественно оценить боковую подвижность, а также выявить различные способы диффузии (Schmidt et al., 1995; Kiessling et al., 2006; Vasquez et al., 2014). Пример изображения справа показывает одиночные Alexa647, помеченные t-SNARE, в обратном контрасте. Фильмы о движущемся белке можно посмотреть на исходном веб-сайте издателя (Domanska et al., 2009). (C) Анализ связывания с использованием микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF). Полностью отраженный лазерный луч создает экспоненциально затухающее электрическое поле на границе раздела стекло / вода. Флуоресцентные молекулы или органеллы, которые связываются на поверхности мембраны, со временем увеличивают наблюдаемую интенсивность флуоресценции I (Kalb et al., 1989). Изотермы связывания могут быть определены с различными концентрациями лиганда и плотностями акцепторов. Данные справа показывают SNARE-специфическое связывание Syb2, меченного Alexa546 (1-96), с поддерживаемой мембраной (Domanska et al., 2009). (D) Анализ TIRF слияния отдельных везикул. Флуоресценцию, исходящую от мембраны (красный, I _M ) или содержимого (зеленый, I _C ) отдельных везикул, можно визуализировать, когда они попадают в исчезающее поле микроскопа TIRF (Fix et al., 2004; Domanska et al. др., 2009). Характерные следы интенсивности стыковочных везикул могут быть проанализированы для определения эффективности стыковки и слияния, а также кинетики слияния (Kiessling et al., 2015b). Данные справа показывают флуоресценцию, исходящую от мембраны и содержимого во время слияния одного пузырька (Kiessling et al., 2015а). (E) Измерение расстояний с помощью микроскопии FLIC. Подложка Si / SiO ₂ с различными ступенями используется для исследования интерференционной картины, возникающей из-за отраженного возбуждения и испускаемого света (Braun and Fromherz, 1997). Подгонка оптической теории к измеренным значениям интенсивности I из различных слоев SiO ₂ позволяет определить расстояние от специфически меченых белковых остатков от поверхности липидного бислоя (Lambacher and Fromherz, 2002; Kiessling and Tamm, 2003).Данные справа показывают кривую FLIC, полученную для Syx, меченного Alexa546, полученную в тех же условиях, что и опубликованные в Liang et al. (2013). Данные в (A) перепечатаны из Wagner and Tamm (2001) с разрешения Elsevier. Данные в (B, C) были первоначально опубликованы в Domanska et al. (2009), © Американское общество биохимии и молекулярной биологии. Данные в (D) перепечатаны из Kiessling et al. (2013) с разрешения Elsevier.

В первых поддерживаемых мембранных анализах с восстановленными белками SNARE Вагнер и Тамм (2001) измерили диффузию t-SNARE, меченных Alexa 488, при различных концентрациях анионных липидов фосфатидилсерина (PS) и фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата (PIP _{). 2} ).В то время как белок очень подвижен при относительно высокой концентрации (l / p 400) в бислое чистого фосфохолина, возрастающие количества PS или PIP ₂ делают большие части t-SNARE неподвижными. Содержание липидов, хотя и в меньшей степени, также частично иммобилизуется. Обращает на себя внимание гораздо более сильный эффект, который PIP ₂ оказывает на подвижность липидов и белков по сравнению с PS, что указывает на сильное взаимодействие между PIP ₂ и t-SNARE Syx1a. Хотя точная причина наблюдаемой зависимости подвижности PIP ₂ и PS не была определена, позже было обнаружено, что кластеризация Syx1a в модельных мембранах также сильно зависит от липидной среды, особенно от холестерина, PS и PIP _{. 2} (Murray, Tamm, 2009; van den Bogaart et al., 2011).

Диффузия белковых доменов периферической мембраны

Прогресс в технологии визуализации за последние 20 лет, особенно в устройствах электронного умножения с заряженной связью (EMCCD) и новейших дополнительных металлооксидных полупроводниковых (CMOS) камерах, позволяет отслеживать индивидуально помеченные молекулы. Опять же, плоская геометрия поддерживаемой мембраны упрощает измерение и интерпретацию траекторий молекул внутри или на мембране (рис. 2В). Мы обычно используем отслеживание отдельных частиц (SPT) для подтверждения подвижности восстановленных мембранных белков (Domanska et al., 2009).

Синаптотагмины — это кальциевые сенсоры высвобождения экзоцитотических нейромедиаторов. Их два домена C2 взаимодействуют с липидным бислоем зависимым от кальция способом, который последовательно запускает слияние мембран и открытие пор посредством все еще обсуждаемого механизма. Поэтому подробная характеристика взаимодействий C2-домен-липид представляет большой интерес. Vasquez et al. (2014) использовали SPT для изучения диффузионного поведения одиночных и тандемных доменов C2 Syt7, сенсора кальция, который запускает медленное асинхронное высвобождение (Schonn et al., 2008). Их результаты согласуются с доменами C2, которые независимо взаимодействуют с липидным бислоем, в отличие от Syt1, сенсора кальция для быстрого синхронного высвобождения, для которого сообщалось о междоменной кооперативности (Sun et al., 2007).

Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения (TIRF)

Плоская геометрия поддерживаемых мембран делает их отличным кандидатом для применения флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF), когда луч света полностью отражается на границе раздела между (стеклянной) подложкой и водой (Axelrod et al., 1983). Флуоресцентные молекулы возбуждаются затухающим электрическим полем, которое экспоненциально затухает, обычно с характерной глубиной проникновения ~ 100–200 нм.

Взаимодействие с мембраной: связывание

Поддерживаемые мембраны и микроскопия TIRF являются идеальной платформой для записи кинетических кривых связывания или изотерм связывания белков и других взаимодействующих с мембранами молекул (рис. 2C; Kalb et al., 1990). Было показано, что растворимый цитозольный фрагмент Syb2, помеченный зеленым флуоресцентным белком (GFP), специфически связывается с поддерживаемыми мембранами, содержащими восстановленные t-SNARE.Результирующий тройной комплекс SNARE может быть затем диссоциирован путем добавления NSF, α-SNAP и ATP, имитирующих физиологический цикл сборки и разборки SNARE (Wagner and Tamm, 2001). Эти эксперименты представляют собой первые функционально успешные воссоздания белков SNARE в поддерживаемых мембранах, описанные в литературе. Исследования связывания с растворимыми C2 доменами Syt и фазово-разделенными асимметричными поддерживаемыми бислоями выявили предпочтение этих доменов в связывании с жидко-неупорядоченными липидными доменами, которые обогащены анионными липидами, по сравнению с жидко-упорядоченными доменами.То же исследование также показало, что Ca ²⁺ зависимое связывание C2 доменов может изменять распределение липидов между двумя фазами (Wan et al., 2011). Воссоздание Syt1 в плоский бислой позволило отслеживать Ca ²⁺ и зависимый от концентрации захват отрицательно заряженных липосом (Lu et al., 2014). Плоские бислои также использовались для исследования роли белка, активированного кальцием, для секреции (CAPS) на стыковку Syb2-содержащих липосом. CAPS, который также подразумевается при стыковке и праймировании, способствует усиленному связыванию липосом Syb2 с планарными бислоями, содержащими PIP ₂ и Syx1a (James et al., 2009).

Мембранно-мембранные взаимодействия: слияние отдельных везикул

Золотым стандартом для экспериментов in vitro SNARE является имитация самой реакции физиологического слияния везикул. Эксперименты с одиночными пузырьками привлекают все большее внимание, потому что они позволяют независимое наблюдение начального события стыковки от фактического события слияния. В то время как анализ отдельных везикул может быть реализован с иммобилизованными протеолипосомами (Yoon et al., 2006; Kyoung et al., 2011; Diao et al., 2013), здесь мы будем обсуждать только тесты слияния мембран, поддерживаемых пузырьками (Рис. 2D). Различные типы обычно используемых анализов слияния отдельных везикул обсуждались в Kiessling et al. (2015a).

Первоначальные попытки анализа слияния отдельных везикул с планарными поддерживаемыми бислоями привели к реакциям слияния, которые не требовали SNAP-25 (Bowen et al., 2004; Liu et al., 2005), были Ca ²⁺ зависимыми в отсутствие Syt (Fix et al., 2004) или привело к разрыву везикул вместо слияния (Wang et al., 2009). Во всех этих экспериментах использовался метод подготовки поддерживаемых мембран с прямым слиянием везикул, и это поднимало вопрос, подходят ли поддерживаемые мембраны вообще для анализов слияния, опосредованного SNARE. Используя поддерживаемые мембраны, полученные с помощью двухэтапного метода LB / VF, мы могли записывать события слияния, которые имитируют физиологические требования SNARE. Здесь стыковка зависит от присутствия Syx1a и SNAP-25 в поддерживаемой мембране, и слияние происходит в течение десятков миллисекунд (Domanska et al., 2009). За реакцией слияния следовал перенос флуоресцентно меченых липидов из липосом, содержащих Syb2, на плоскую мембрану. Быстрое изменение (~ 8 мс) ориентации диполей флуорофоров относительно поляризации исчезающего поля, когда меченые липиды переносятся от сферической мембраны везикул на плоскую поддерживаемую мембрану, создает сигнатурный сигнал для начала слияния (Kiessling et al. ., 2010), которые можно использовать для точного определения кинетики синтеза.Анализ кинетики слияния, измеренной в среде липидов 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (POPC) / холестерина, показал, что между стыковкой везикул и началом слияния должно происходить восемь параллельных реакций (Domanska и др., 2009). Вероятно, что эти реакции представляют собой образование восьми комплексов SNARE в месте слияния. Каратекин и др. (2010) позже обнаружили аналогичные требования к количеству SNARE, хотя условия эксперимента были очень разными.В этой работе очень низкая концентрация t-SNARE была восстановлена ​​в полиэтиленгликоль (PEG), содержащем поддерживаемую мембрану, и времена задержки слияния были смоделированы с помощью модели диффузионной реакции. Позже мы показали, что кинетика слияния сильно зависит от липидного окружения. Систематическое введение до 30 мол.% Фосфоэтаноламина (PE) и 5 ​​мол.% PS в везикулу и / или поддерживаемую мембрану снижает количество параллельных реакций, то есть количество необходимых комплексов SNARE до 3 (Domanska et al., 2010). Вариабельность кооперативности SNARE в чисто SNARE-опосредованном слиянии мембран дополнительно исследовали путем комбинирования анализов слияния массы и одиночных везикул. В то время как маленькие (~ 40 нм) сильно изогнутые липосомы были фузогенными только с одной Syb2 / липосомой, большие (~ 100 нм) липосомы нуждались в 23-30 Syb2 / липосомах для эффективного слияния (Hernandez et al., 2014). Наблюдение за переносом красителя из липосом в небольшую щель между субстратом и поддерживаемой мембраной подтвердило продуктивное слияние (Kiessling et al., 2013) и позволили легко различить события полного и полуслияния. Увеличение количества холестерина либо в поддерживаемой мембране, либо в мембране везикул смещает баланс от непродуктивного полуслияния к продуктивному полному слиянию (Kreutzberger et al., 2015) и может повысить стабильность поры слияния (Stratton et al., 2016 ). Хотя холестерин может влиять на слияние мембран по-разному (Yang et al., 2016), мы связали наши наблюдения со стабилизацией промежуточных продуктов за счет внутренней кривизны холестерина (Kreutzberger et al., 2015). Физиологическая значимость этого анализа была подтверждена, когда мы использовали гибридную систему, состоящую из очищенных синаптических везикул из головного мозга крысы и поддерживаемой мембраны, содержащей рекомбинантные SNARE плазматической мембраны. Синаптические везикулы и липосомы, содержащие Syb2 и Syt1, обнаруживают повышенную эффективность слияния в присутствии Ca ²⁺ и анионных липидов (Kiessling et al., 2013).

Исследование конформации белков в мембране: флуоресцентная интерференционная контрастная микроскопия (FLIC)

FLIC-микроскопия — это метод интерферометрической флуоресцентной микроскопии, который измеряет расстояние от плоского флуоресцентного слоя, перпендикулярного отражающей поверхности раздела, и первоначально был разработан для измерения расстояния прикрепленных клеточных мембран от субстрата (Lambacher and Fromherz, 1996; Braun and Fromherz, 1997 , 1998).Интерференционный контраст возникает из-за возбуждающего и испускаемого света флуорофоров перед зеркалом на разных расстояниях. На практике зеркало реализуется посредством интерфейса Si / SiO ₂ на кремниевой пластине с рисунком (Braun, Fromherz, 1997, 1998; Kiessling, Tamm, 2003; Liang et al., 2013). После подготовки образца на подложке FLIC достаточно простого эпифлуоресцентного микроскопа с лампой в качестве источника возбуждения для записи изображений, из которых извлекаются интенсивности различных террас (рис. 2E).Оптическая теория, которая учитывает спектры возбуждения и излучения микроскопа, детектора и флуорофора, числовую апертуру объектива, ориентацию диполя и квантовый выход флуорофора, а также систему оптических слоев, которая включает поддерживаемую мембрану, подходит для данные, чтобы получить желаемое расстояние по оси Z (Lambacher and Fromherz, 2002). Точность результирующего расстояния по оси Z определяется систематическими ошибками, вызванными допущениями или измерениями различной толщины оптического слоя (оксид, водный слой, мембрана), и статистическими ошибками, вызванными подгонкой и неоднородностью образца.

Хотя первое применение FLIC все еще было ограничено доступными субстратами и относительно большим размером метки, расстояние между N-концевой меткой GFP в конструкции Syb2 внутри комплекса SNARE соответствовало кристаллической структуре цис-метки. Комплекс SNARE был опубликован позже (Kiessling, Tamm, 2003; Stein et al., 2009). Совсем недавно мы использовали белки, меченные Alexa, для проведения сайт-ориентированной микроскопии FLIC. Различные положения метки позволяют определить точную картину ориентации белка относительно липидного бислоя.С этими яркими метками погрешность абсолютного расстояния составляет порядка 1-2 нм. Изменения расстояния, которые могут произойти после взаимодействия интересующего белка с лигандами, которые были добавлены к образцу, можно измерить с точностью менее 1 нм.

При воссоздании меченых интегральных белков плазматической мембраны, мы можем воспользоваться процедурой приготовления поддерживаемой мембраны, описанной выше, для получения правильно ориентированных белков, а также асимметричных липидных композиций между двумя листками бислоя.Недавно, определяя расстояния двух остатков на N-конце или центре Syx1a SNARE мотива от поверхности мембраны, мы показали, что цитоплазматический домен мономерного Syx1a лежит на поверхности бислоя. Интересно, что образование комплексов внутри стабилизированного акцепторного комплекса SNARE, состоящего из Syx, SNAP25 и Syb2 (49–96), или внутри тройного комплекса SNARE приводит к более вертикальному положению (Liang et al., 2013).

Outlook

Чтобы решить давние вопросы о том, как аппарат слияния секреторных пузырьков достигает своей точной и надежной функции, необходимо использовать множество различных подходов.Многое было изучено о молекулярных требованиях из in vivo и клеточных экспериментов, и многие механистические картины были нарисованы на основе структур атомарного разрешения растворимых белков или белковых фрагментов. Тем не менее, нам нужны тщательно контролируемые эксперименты по восстановлению in vitro , которые проводятся в присутствии определенных липидных бислоев, чтобы получить дополнительную информацию. Вышеупомянутые флуоресцентные анализы с поддерживаемыми мембранами, на наш взгляд, являются одними из наиболее многообещающих направлений, поскольку они могут предоставить количественные биохимические и функциональные данные, а также структурную информацию без игнорирования важных характеристик биологической мембраны, таких как ориентация белков, подвижность и липидная асимметрия. .Сопоставление результатов этих различных анализов и учет того, что образцы с почти идентичными условиями могут быть приготовлены для ряда различных структурных и функциональных анализов, еще больше повышает их ценность. Мы очень оптимистично настроены, что описанные подходы вскоре внесут значительный вклад в решение многих оставшихся загадок о точных молекулярных взаимодействиях, которые лежат в основе механизма запускаемого Ca ²⁺ экзоцитоза и слияния синаптических пузырьков.

Авторские взносы

VK, BL, AJBK и LKT.

Финансирование

NIH грант P01 GM72694.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим всех бывших и нынешних сотрудников лаборатории Тамма, которые внесли свой вклад в анализы, описанные в этой обзорной статье.

Список литературы

Бейкер Р.В., Джеффри, П. Д., Зик, М., Филлипс, Б. П., Викнер, В. Т., и Хьюсон, Ф. М. (2015). Прямая роль белка Vps33 семейства Sec1 / Munc18 в качестве матрицы для сборки SNARE. Наука 349, 1111–1114. DOI: 10.1126 / science.aac7906

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Боуэн, М. Э., Венингер, К., Брюнгер, А. Т., и Чу, С. (2004). Наблюдение за одной молекулой слияния липосомы и бислоя, термически индуцируемого растворимыми рецепторами белка прикрепления, чувствительного к N-этилмалеимиду (SNARE). Biophys. J. 87, 3569–3584. DOI: 10.1529 / biophysj.104.048637

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Браун Д. и Фромхерц П. (1997). Флуоресцентная интерференционная контрактная микроскопия клеточной адгезии на кремнии. Заявл. Phys. Матер. Sci. Процесс. 65, 341–348. DOI: 10.1007 / s0033

589

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Браун Д. и Фромхерц П. (1998). Флуоресцентная интерферометрия адгезии нервных клеток на микроструктурированном кремнии. Phys. Rev. Lett. 81, 5241–5244. DOI: 10.1103 / Physrevlett.81.5241

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Крейн, Дж. М., Кисслинг, В., и Тамм, Л. К. (2005). Измерение липидной асимметрии в плоских поддерживаемых бислоев с помощью флуоресцентной интерференционной контрастной микроскопии. Langmuir 21, 1377–1388. DOI: 10.1021 / la047654w

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дяо, Дж., Чжао, М., Чжан, Ю., Кён, М., и Брюнгер, А.Т. (2013). Изучение протеин-реконструированного слияния протеолипосом с индикаторами содержания in vitro . Bioessays 35, 658–665. DOI: 10.1002 / bies.201300010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Domanska, M.K., Kiessling, V., Stein, A., Fasshauer, D., and Tamm, L.K. (2009). Кинетика миллисекундного слияния одиночных везикул показывает количество комплексов SNARE, оптимальных для быстрого слияния мембран, опосредованного SNARE. J. Biol. Chem. 284, 32158–32166.DOI: 10.1074 / jbc.M109.047381

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Domanska, M., Kiessling, V., and Tamm, L. (2010). Стыковка и быстрое слияние синаптобревиновых везикул зависит от липидного состава везикулы и мембраны-мишени, содержащей акцепторный комплекс SNARE. Biophys. J. 99, 2936–2946. DOI: 10.1016 / j.bpj.2010.09.011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фикс, М., Мелия, Т. Дж., Джайсвал, Дж.К., Раппопорт, Дж. З., Ю, Д., Зёлльнер, Т. Х. и др. (2004). Визуализация событий слияния одной мембраны, опосредованных белками SNARE. Proc. Natl. Акад. Sci. U S A 101, 7311–7316. DOI: 10.1073 / pnas.0401779101

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эрнандес, Дж. М., Кройцбергер, А. Дж., Кисслинг, В., Тамм, Л. К., и Ян, Р. (2014). Переменная кооперативность при слиянии мембран, опосредованном SNARE. Proc. Natl. Акад. Sci. США 111, 12037–12042.DOI: 10.1073 / pnas.1407435111

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джеймс Д. Дж., Ковальчик Дж., Дейли Н., Петри М. и Мартин Т. Ф. (2009). CAPS управляет образованием комплексов trans-SNARE и слиянием мембран посредством синтаксиновых взаимодействий. Proc. Natl. Акад. Sci. U S A 106, 17308–17313. DOI: 10.1073 / pnas.05106

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кальб, Э., Энгель, Дж., И Тамм, Л. К. (1989).Связывание белков с конкретными целевыми участками на мембранах, измеренное с помощью флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения. Biol. Chem. Хоппе Сейлер 370, 915–915.

Кальб, Э., Энгель, Дж., И Тамм, Л. К. (1990). Связывание белков с конкретными целевыми участками на мембранах, измеренное с помощью флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения. Биохимия 29, 1607–1613. DOI: 10.1021 / bi00458a036

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Калб, Э., Фрей, С., и Тамм, Л. К. (1992). Формирование поддерживаемых плоских бислоев путем слияния везикул с поддерживаемыми фосфолипидными монослоями. Biochim. Биофиз. Acta 1103, 307–316. DOI: 10.1016 / 0005-2736 (92) _-q

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Каратекин, Э., Ди Джованни, Дж., Иборра, К., Коулман, Дж., О’Шонесси, Б., Сигар, М., и др. (2010). Быстрый анализ слияния отдельных везикул имитирует физиологические требования SNARE. Proc. Natl.Акад. Sci. U S A 107, 3517–3521. DOI: 10.1073 / pnas.0914723107

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кисслинг В., Ахмед С., Доманска М. К., Холт М. Г., Ян Р. и Тамм Л. К. (2013). Быстрое слияние синаптических везикул с восстановленными целевыми мембранами SNARE. Biophys. J. 104, 1950–1958. DOI: 10.1016 / j.bpj.2013.03.038

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кисслинг, В., Крейн, Дж.М., Тамм, Л. К. (2006). Трансбислойные эффекты рафтообразных липидных доменов в асимметричных планарных бислоях, измеренные с помощью отслеживания одиночных молекул. Biophys. J. 91, 3313–3326. DOI: 10.1529 / biophysj.106.091421

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кисслинг, В., Доманска, М., Тамм, Л. (2010). Одиночное SNARE-опосредованное слияние везикул, наблюдаемое in vitro и с помощью поляризованного TIRFM. Biophys. J. 99, 4047–4055. DOI: 10.1016 / j.bpj.2010.10.022

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кисслинг В., Лян Б. и Тамм Л. К. (2015a). Восстановление опосредованного SNARE слияния мембран на уровне отдельных липосом. Methods Cell Biol. 128, 339–363. DOI: 10.1016 / bs.mcb.2015.02.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кисслинг В., Тамм Л. К. (2003). Измерение расстояний в поддерживаемых бислоях с помощью флуоресцентной интерференционно-контрастной микроскопии: полимерные подложки и белки SNARE. Biophys. J. 84, 408–418. DOI: 10,1016 / s0006-3495 (03) 74861-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Крейцбергер А. Дж., Кисслинг В., Тамм Л. К. (2015). Высокий холестерин устраняет пролонгированное промежуточное звено гемифузии при быстром слиянии мембран, опосредованном SNARE. Biophys. J. 109, 319–329. DOI: 10.1016 / j.bpj.2015.06.022

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Крейцбергер, А. Дж., Лян, Б., Кисслинг В., Тамм Л. К. (2016). Сборка и сравнение акцепторных комплексов SNARE плазматической мембраны. Biophys. J. 110, 2147–2150. DOI: 10.1016 / j.bpj.2016.04.011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Kyoung, M., Srivastava, A., Zhang, Y., Diao, J., Vrljic, M., Grob, P., et al. (2011). in vitro Система , способная отличать быстрое смешение содержимого, инициируемое Ca2 +, от липидного обмена для механистических исследований высвобождения нейромедиаторов. Proc. Natl. Акад. Sci. U S A 108, E304 – E313. DOI: 10.3410 / f.12007956.13137054

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Lambacher, A., and Fromherz, P. (1996). Флуоресцентная интерференционно-контрастная микроскопия окисленного кремния с использованием мономолекулярного слоя красителя. Заявл. Phys. А. 63, 207–216. DOI: 10.1007 / s0033

374

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Lambacher, A., and Fromherz, P. (2002). Люминесценция молекул красителя на окисленном кремнии и флуоресцентная интерференционно-контрастная микроскопия биомембран. J. Opt. Soc. Являюсь. B 19, 1435–1453. DOI: 10.1364 / josab.19.001435

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лян Б., Кисслинг В. и Тамм Л. К. (2013). Структура до слияния синтаксина-1A предполагает путь для сворачивания в промежуточный продукт слияния нейронального транс-SNARE-комплекса. Proc. Natl. Акад. Sci. U S A 110, 19384–19389. DOI: 10.1073 / pnas.1314699110

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лу, Б., Кисслинг, В., Тамм, Л. К., и Кафисо, Д. С. (2014). Юкстамембранный линкер полноразмерного синаптотагмина 1 контролирует олигомеризацию и кальций-зависимое связывание с мембраной. J. Biol. Chem. 289, 22161–22171. DOI: 10.1074 / jbc.M114.569327

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лю Т., Такер В. К., Бхалла А., Чепмен Е. Р. и Вайсхаар Дж. К. (2005). Управляемое SNARE, 25-миллисекундное слияние везикул in vitro . Biophys. J. 89, 2458–2472.DOI: 10.1529 / biophysj.105.062539

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ма, К., Су, Л., Севен, А. Б., Сюй, Ю. и Ризо, Дж. (2013). Восстановление жизненно важных функций Munc18 и Munc13 при высвобождении нейромедиаторов. Наука 339, 421–425. DOI: 10.1126 / science.1230473

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Максимов А., Зюдхоф Т. К. (2005). Автономная функция синаптотагмина 1 при запуске синхронного высвобождения независимо от асинхронного высвобождения. Нейрон 48, 547–554. DOI: 10.1016 / j.neuron.2005.09.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Максимов А., Тан Дж., Янг X., Панг З. П. и Судхоф Т. К. (2009). Комплексин контролирует передачу силы от комплексов SNARE к мембранам при слиянии. Наука 323, 516–521. DOI: 10.1126 / science.1166505

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мюррей, Д. Х., Тамм, Л. К. (2009). Кластеризация синтаксина-1a в модельных мембранах модулируется фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфатом и холестерином. Биохимия 48, 4617–4625. DOI: 10.1021 / bi17

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Перин М.С., Фрид В.А., Миньери Г.А., Ян Р. и Зюдхоф Т.С. (1990). Связывание фосфолипидов белком синаптических везикул, гомологичным регуляторной области протеинкиназы C. Nature 345, 260–263. DOI: 10.1038 / 345260a0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Перин, М.С., Джонстон, П.А., Озчелик Т., Ян Р., Франк У. и Зюдхоф Т. К. (1991). Структурная и функциональная консервация синаптотагмина (p65) у дрозофилы и человека. J. Biol. Chem. 266, 615–622.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Шмидт, Т., Шутц, Г. Дж., Баумгартнер, В., Грубер, Х. Дж., И Шиндлер, Х. (1995). Характеристика фотофизики и подвижности одиночных молекул в жидкой липидной мембране. J. Phys. Chem. 90, 17662–17668. DOI: 10.1021 / j100049a030

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шонн, Дж.-S., Максимов, А., Лао, Ю., Зюдхоф, Т. К., и Соренсен, Дж. Б. (2008). Синаптотагмин-1 и -7 являются функционально перекрывающимися сенсорами Ca2 + для экзоцитоза в хромаффинных клетках надпочечников. Proc. Natl. Акад. Sci. U S A 105, 3998–4003. DOI: 10.1073 / pnas.0712373105

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Смит, Б. А., и МакКоннелл, Х. М. (1978). Определение молекулярного движения в мембранах с использованием периодического фотообесцвечивания. Proc. Natl. Акад.Sci. U S A 75, 2759–2763. DOI: 10.1073 / pnas.75.6.2759

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Штейн А., Вебер Г., Валь М. К. и Ян Р. (2009). Спиральное расширение нейронального комплекса SNARE в мембрану соединяет застежки-молния с мембранным слиянием. Природа 460, 525–528. DOI: 10.1038 / nature08156

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Страттон, Б.С., Уорнер, Дж. М., Ву, З., Николаус, Дж., Wei, G., Wagnon, E., et al. (2016). Холестерин увеличивает открытость опосредованных SNARE мерцающих пор слияния. Biophys. J. 110, 1538–1550. DOI: 10.1016 / j.bpj.2016.02.019

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сан, Дж., Панг, З. П., Цинь, Д., Фахим, А. Т., Адачи, Р., и Судхоф, Т. К. (2007). Модель двойного Ca2 + -сенсора для высвобождения нейромедиатора в центральном синапсе. Природа 450, 676–682. DOI: 10.1038 / nature06308

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тамм, Л.К. (1984). Субстрат поддерживает липидный бислой — новую модельную мембранную систему. Клин. Wochenschr. 62, 502–503.

Google Scholar

Тамм, Л. К., и Калб, Э. (1993). «Микроспектрофлуориметрия на поддерживаемых плоских мембранах», в Molecular Luminescence Spectroscopy, Part 3 , ed. С. Г. Шульман. (Хобокен, Нью-Джерси: John Wiley & Sons), 253–305.

ван ден Богаарт, Г., Мейенберг, К., Рисселада, Х. Дж., Амин, Х., Виллиг, К. И., Хубрих, Б. Э., и другие. (2011). Секвестрация мембранных белков за счет ионных белок-липидных взаимодействий. Природа 479, 552–555. DOI: 10.1038 / природа10545

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Васкес, Дж. К., Чантрануватана, К., Джардина, Д. Т., Коффман, М. Д., и Найт, Дж. Д. (2014). Боковая диффузия белков на поддерживаемых липидных бислоях: аддитивное трение тандемных доменов синаптотагмина 7 C2A-C2B. Биохимия 53, 7904–7913. DOI: 10.1021 / bi5012223

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Верхаге, М., Maia, A. S., Plomp, J. J., Brussaard, A. B., Heeroma, J. H., Vermeer, H., et al. (2000). Синаптическая сборка мозга при отсутствии секреции нейромедиаторов. Наука 287, 864–869. DOI: 10.1126 / science.287.5454.864

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вагнер М. Л., Тамм Л. К. (2000). Связанные на полимерной основе плоские липидные бислои для восстановления интегральных мембранных белков: силан-полиэтиленгликоль-липид в качестве подушки и ковалентного линкера. Biophys. J. 79, 1400–1414. DOI: 10.1016 / s0006-3495 (00) 76392-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вагнер М. Л., Тамм Л. К. (2001). Восстановленный синтаксин1A / SNAP25 взаимодействует с отрицательно заряженными липидами, что измеряется латеральной диффузией в плоских поддерживаемых бислоях. Biophys. J. 81, 266–275. DOI: 10,1016 / s0006-3495 (01) 75697-4

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван, К., Кисслинг В., Кафисо Д. С. и Тамм Л. К. (2011). Разделение доменов синаптотагмина I C2 между жидкоупорядоченными и жидко-неупорядоченными липидными фазами внутреннего листка. Биохимия 50, 2478–2485. DOI: 10.1021 / bi101864k

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван Т., Смит Э. А., Чепмен Э. Р. и Вайсхаар Дж. К. (2009). Смешивание липидов и высвобождение содержимого в одиночном везикулярном анализе слияния на основе SNARE с разрешением 1–5 мс. Biophys.J. 96, 4122–4131. DOI: 10.1016 / j.bpj.2009.02.050

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Weber, T., Zemelman, B.V., McNew, J.A., Westermann, B., Gmachl, M., Parlati, F., et al. (1998). SNAREpins: минимальное оборудование для слияния мембран. Cell 92, 759–772. DOI: 10.1016 / s0092-8674 (00) 81404-x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Xue, M., Reim, K., Chen, X., Chao, H. T., Deng, H., Rizo, J., et al.(2007). Отдельные домены комплексина I по-разному регулируют высвобождение нейромедиатора. Nat. Struct. Мол. Биол. 14, 949–958. DOI: 10.1038 / nsmb1292

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Янг, X., Kaeser-Woo, Y.J., Pang, Z.P., Xu, W., and Sudhof, T.C. (2010). Комплексин сдерживает асинхронное высвобождение, блокируя вторичный датчик Ca2 + через его вспомогательную β-спираль. Нейрон 68, 907–920. DOI: 10.1016 / j.neuron.2010.11.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ян, С.Т., Кройцбергер, А.Дж., Ли, Дж., Кисслинг, В., и Тамм, Л.К. (2016). Роль холестерина в слиянии мембран. Chem. Phys. Липиды 199, 136–143. DOI: 10.1016 / j.chemphyslip.2016.05.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Юн, Т.-Й., Окумус, Б., Чжан, Ф., Шин, Ю.-К., и Ха, Т. (2006). Множественные промежуточные соединения в индуцированном SNARE слиянии мембран. Proc. Natl. Акад. Sci. США 103, 19731–19736. DOI: 10.1073 / pnas.0606032103

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Bad For You — Единорог Frappuccino Starbucks

Это случается не часто, но время от времени мы, журналисты, пишем о еде, получаем ГЛАВНЫЕ НОВОСТИ .Это означает, что мне пришлось отказаться от очень важных планов по просмотру борьбы и приступить к работе.

В данном случае большой историей стало объявление Starbucks об ограниченном по времени использовании Unicorn Frappuccino, которое будет доступно только в течение пяти дней на этой неделе. Хотя у нас уже было готово другое издание «Bad For You», как я мог не рассмотреть что-то под названием «Фраппучино с единорогом», которое якобы меняет вкус, когда вы его перемешиваете? Это как то, что пили бы The New Day, если бы им нравились фраппучино.

• Цена: 5 долларов.19
  
• Доступно по адресу: Starbucks
  
• До: воскресенье, 23 апреля
  

Я сказал своим кошкам держать все мои звонки, чтобы я мог сосредоточиться. Поскольку мне не было звонков, я полагаю, что технически они выполняли свою работу.

Я пошел в одно из примерно 3000 заведений Starbucks в городе, и там работники сказали, что весь день продают тонны напитков. Табличка за прилавком обещала, что фраппучино «Единорог» изготовлена ​​«только из самых свежих цветов радуги».

Одна из самых больших жалоб, которые я прочитал в Интернете во время исследования, — помимо того, что у напитка был ужасный вкус — заключалась в том, что он не выглядел так, как на картинке.

Мы уверены, что именно здесь появились фраппучино Unicorn.

Тем не менее, это был один из немногих, который, как мне показалось, отлично смотрелся на его рекламной фотографии. Эстетически эта вещь похожа на произведение искусства, по крайней мере, в плане фраппучино. Пурпурные и синие узоры тай-дай придали напитку неповторимый вид. Сверху была хорошая порция взбитых сливок, наслоенных розовыми и синими брызгами, и вид, который действительно достоин своего имени единорога.Он идеально подходит для фотографий в Instagram.

В то время как шоколадный Shamrock Shake имел сверху зеленую посыпку, которая почти не имела вкуса, посыпка на этом давала мощный удар — мощный, отвратительный удар. Фотограф Том написал мне, чтобы я сам съел немного взбитых сливок, покрытых оболочкой (точная цитата гласила, что «это вызвало у [его] настоящую реакцию»), и я не рад, что я сделал. На вкус он напоминал измельченные сверхкислые боеголовки.

Starbucks Unicorn Frappuccino после смешивания.

Я быстро сделал глоток напитка, чтобы смыть вкус, и был рад узнать, что это было совсем неплохо. Сироп манго придавал ему вкус фруктового смузи. Кислые брызги в сторону, смутил весь люфт.

Потом перемешал. Вся фишка напитка в том, что он не только меняет цвет, когда вы все смешиваете, но и меняет вкус.После пары оборотов соломинкой я сразу почувствовал ненависть. Сладкий вкус манго был прерван смешиванием слишком терпкого голубого сиропа. Чем больше я перемешивал, тем хуже было на вкус. Чем хуже было на вкус, тем злее я становился. Когда я гулял по Старому городу, запах навоза от некрогих лошадей-ловушек для туристов был после этого глотком свежего воздуха.

Starbucks просто всех троллит? Они привлекли внимание всего мира этим красивым напитком, и им пришлось испортить его, добавив кучу лимонной кислоты, которая обжигает вам язык.Почему они сделали это таким кислым? Без этой синей штуки эта штука была бы неплохой. С этим все плохо. Честно говоря, я не мог избавиться от привкуса во рту минут 20 после того, как выбросил эту штуку в мусорный бак.

Я также хотел бы отметить, что недавно я отказался от кофеина после серьезной зависимости от энергетических напитков. Это означает, что мне пришлось отказаться от привычки пить это психоделическое чудовище. Через пару недель, когда я буду пить баночки Monster, я буду винить этот напиток в том, что заставил меня упасть с повозки — повозки, запряженной благословением единорогов.

Правильно, группа единорогов называется благословением.

Вердикт : Абсолютно нет. Это пощечина единорогам повсюду.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

FRAP F1052-8 Прочный простой смеситель для раковины с холодной водой с одной ручкой, смеситель для кухонной раковины для напитков,

Описание продукта

Описание:

Frap F1052-8 Прочный простой смеситель для раковины с холодной водой с одной ручкой Смеситель для кухонной раковины для напитков

Вращающаяся конструкция упрощает установку и очистку.

Надежность и долговечность, отсутствие капель, гладкость, устойчивость к царапинам, коррозии и потускнению.

Спецификация:

В пакет включено:

Смеситель Frap F1052-8 1 x

Более подробные фотографии:

Дополнительная информация

При заказе от Alexnld.com, вы получите электронное письмо с подтверждением. Как только ваш заказ будет отправлен, вам будет отправлено электронное письмо с информацией об отслеживании доставки вашего заказа. Вы можете выбрать предпочтительный способ доставки на странице информации о заказе во время оформления заказа. Alexnld.com предлагает 3 различных метода международной доставки, авиапочту, зарегистрированную авиапочту и службу ускоренной доставки, следующие сроки доставки:

Мы принимаем оплату через PayPal ， и кредитную карту.

Оплата через PayPal / кредитную карту —

ПРИМЕЧАНИЕ. Ваш заказ будет отправлен на ваш адрес PayPal. Убедитесь, что вы выбрали или ввели правильный адрес доставки.

1) Войдите в свою учетную запись или воспользуйтесь кредитной картой Express.

2) Введите данные своей карты, и заказ будет отправлен на ваш адрес PayPal. и нажмите «Отправить».

3) Ваш платеж будет обработан, и квитанция будет отправлена ​​на ваш почтовый ящик.

Grappe означает

Это означает, что Grapple — это не помесь яблока и винограда, а скорее помесь яблока и, скажем, Big League Chew. Нельзя сказать, что их запатентованный процесс прост: вы можете посмотреть видео изобретателя …

Правила борьбы не говорят ничего о размере, кроме того, что вы не можете схватить что-то на два или более размера больше вас, и что ваша скорость уменьшается вдвое во время схватки, если схваченное существо на два или более размера меньше вас.Согласно RAW, никакие проверки грейфера не дают преимущества из-за размера. Assemblage de fruit ou de fleurs Disposés par étage et soutenus sur un ax commun. Виноград де изюм. Grappe de groseilles. Par extension, il se dit de choses Disées из винограда с изюмом. Terme de peinture. Grappe de raisin, terme employeeé par le Titien, et devenu, техника для разрушения … схватка с (кем-то или чем-то) схватка с (кем-то или чем-то) 1. Физическая борьба с кем-то другим, чтобы получить что-то.В этом использовании существительное или местоимение может использоваться между «схватиться» и «с». Я схватился за мяч с одним из игроков другой команды. 2. Испытывать трудности в понимании или управлении чем-либо. 07 декабря 2020 г. · Пустая зачетная книжка: пока учащиеся борются с дистанционным обучением, учителя борются с Fs. Учащиеся начальной школы вернутся в очную школу в Нью-Йорке 7 декабря 2020 г. Когда Ана Баррос …

2 февраля 2019 г. · Европа борется с различием между беженцами и экономическими мигрантами.Противостояние с участием спасательного корабля — последний пример ужесточения отношения к новичкам в ЕС. страны. Grapple определяется как борьба с чем-то или кем-то. Примером борьбы является борьба двух детей из-за мяча, каждый из которых пытается получить контроль. Пример борьбы — когда вы пытаетесь принять трудное решение. глагол 3 1 Grapnel. существительное 2023 сентября, 2021 · «Схватка», как следует из вашего определения, обычно сильнее и подразумевает какую-то борьбу («схватка» происходит от того же корня, что и «схватить» и «схватить», и буквально означает «схватить» чего-либо).Он используется для более экзистенциальных вещей; Вы бы не сказали: «Я буду бороться с посудой», разве что в шутку. Вместо этого это … Моя семья переехала в США для лучшей жизни. Но что это на самом деле означает? | В этом отрывке из книги «Консепсьон: судьба иммигрантской семьи» филиппинская семья пытается понять смысл американской мечты.

бороться с (кем-то или чем-то) бороться с (кем-то или чем-то) 1. Физически бороться с кем-то еще, чтобы получить что-то. В этом случае существительное или местоимение может использоваться между «схватиться» и «с».«Я схватился за мяч с одним из игроков другой команды. 2. Я испытываю трудности с пониманием или управлением чем-либо. Перевод слова« схватка »в бесплатном англо-хинди словаре и многие другие переводы на хинди. Моя утренняя куртка вернулась с новой песней «Regularly Scheduled Programming» из их грядущего одноименного альбома, который выходит 22 октября на лейбле ATO Records. «Regularly Scheduled Programming … Определение grapple в словаре Definitions.net. Значение схватки. Информация и переводы слова grapple в наиболее полном объеме словарных определений в Интернете.GRAPNEL Значение: «маленький крючок», особенно тот, который закреплен на веревке и брошен для захвата и удержания, конец 14 века, грапенель,… См. Определения grapnel. Простое схватывание в настоящем единственном числе третьего лица, схватка причастия настоящего времени, простое причастие прошедшего и прошедшего времени схватился. Чтобы что-то схватить и крепко удерживать. образно обдумать и тщательно оценить проблему; обычно используется с «с». Использовать грейфер. Чтобы бороться или драться. Пристегнуть, как грейферой; чинить; Значение Grapple на английском языке — определение, синонимы и противоположность слову «Grapple» можно найти здесь.Англо-английский словарь дает вам лучший и точный английский перевод, примеры, предложения и значения Grapple в HamariWeb Dictionary. Определение Grapple от The Free Dictionary. 1 ч. Назад grap · ple (grăp′əl) n. 1. а. Железное древко с когтями на одном конце, обычно перебрасываемое веревкой и используемое для захвата и удержания, особенно для того, чтобы тянуть и удерживать вражеский корабль рядом. Также называется грейфер, грейфер, грейфер, грейфер. б. схватка с определением sth: 1.попытаться разобраться или понять сложную проблему или предмет: 2. попытаться разобраться или…. Узнать больше. Определение Death grapple в Fine Dictionary. Смысл схватки Смерти с иллюстрациями и фотографиями. Произношение Death grapple и его этимология. Родственные слова — синонимы, антонимы, гиперонимы и гипонимы Death grapple. Примеры предложений, содержащих Death grapple: «Города борются с легальным сорняком», что означает открытие рынка марихуаны для взрослых в Монтане через пять месяцев. А пока местным властям предстоит решить, как будет выглядеть легализация в их общинах.Джастин Франц 08.05.2021 08.12.2021.Суд над Гуантанамо будет бороться с определением пыток Почти два десятилетия попытки привлечь к ответственности мужчин, обвиняемых в содействии осуществлению террористических атак 11 сентября, ни к чему не привели. Но … 5 мая 2016 г. · Собственность — в виде земли — была основной причиной насилия на границе с Техасом, которое произошло во втором десятилетии 20-го века. На рубеже 20 веков эпопея, часто …

Шаг 3. Держи. Сделайте встречную проверку захвата как свободное действие.Если вам это удалось, вы и ваша цель теперь сражаетесь, и вы наносите урон цели, как если бы невооруженным ударом. Если вы проиграете, вы не сможете начать схватку. Вы автоматически теряете попытку удержания, если цель на две или более категории размеров больше вас.

Логотип Pride или нет логотипа Pride? Компании все еще не могут понять, что значит быть союзником ЛГБТК +. Софи Меллор. 23 июня 2021 г., 5:40 AM … Стержень (16) зубьев грейфера съемно прикреплен к монтажному кронштейну (24) планки зубьев грейфера, по крайней мере, одним механизмом (26, 28) крепления таким образом, что крепежное устройство (10) могут устанавливаться на ковши погрузчика (12) или вилы (13) различной ширины и могут принимать штанги (16) с зубьями грейфера различной длины.Определение слова grappe в словаре Definitions.net. Значение винограда. Что значит виноград? Информация и переводы слова grappe в наиболее полном объеме словарных определений в Интернете. Борьба в приговоре 🔉. Он знал, что, когда его жена уехала из города, ему придется всю неделю бороться с детьми. Борца учат бороться со своим противником, чтобы добиться победы. Возможно, это не лучшая идея — сражаться с кем-то вдвое больше вас. Возможно, это не лучшая идея — сражаться с кем-то вдвое больше вас.Что наоборот … G35. 28 декабря 2019 г., французский (Франция) @ beroe36 Lâcher la grappe = laisser tranquille, arrêter d’importuner. @ beroe36 Lâcher la grappe = laisser tranquille, arrêter d’importuner. Смотрите перевод. Сообщите о нарушении авторских прав. 1 нравится 0 не согласен.

схватиться с чем-то значение, определение, что такое схватка с чем-то: изо всех сил пытаться справиться или понять с …: Узнать больше. Определение и синонимы слова «схватка» в онлайн-словаре английского языка от Macmillan Education.. Это британское определение грейферного захвата. Посмотрите определение грейферного погрузчика на американском английском. Измените словарь по умолчанию на американский английский. Томагавк Attachments — ваш главный прямой источник для всех видов навесного оборудования для мини-погрузчиков. Наше высококачественное навесное оборудование американского производства подходит для большинства марок и моделей бортовых погрузчиков. Обзор словарной статьи: что означает схватка? • GRAPPLE (существительное) Существительное GRAPPLE имеет 3 значения :. 1. инструмент, состоящий из нескольких крючков для захвата и удержания; часто бросали с веревкой 2.дноуглубительное ведро с петлями, похожими на раковину моллюска. 3. Акт вступления в рукопашный бой. Информация для знакомства: ГРЕЙФЛ, используемый как существительное, встречается редко. … Определение грэпплинга в словаре Definitions.net. Значение борьбы. Что значит борьба? Информация и переводы о грэпплинге в наиболее исчерпывающем ресурсе словарных определений на веб-сайте. Grappe (французское означает гроздь винограда) — это программа сопоставления с образцом, разработанная в проекте Adage в LORIA. Краткое введение в grappe grappe — это программа сопоставления с образцом.

Окна Wstunnel.

Взводы острова Пэррис 1968
Zpacks arc air review

5 мая 2016 г. · Собственность — в виде земли — была основной причиной насилия на границе Техаса, имевшего место во втором десятилетии 20-го века.