8-3842-33-85-00 - магазин жидких обоев

г. Кемерово, Рынок "Привоз" бокс №1

Заделка гкл швов: как и чем заделать стыки между гипсокартонными листами под обои

Содержание

как и чем заделать стыки между гипсокартонными листами под обои

Гипсокартон – это популярный податливый материал, который чаще всего используют для выравнивания различных поверхностей. Это могут быть неровные стены, пол или потолок. Монтаж подобных элементов является достаточно простым, однако, по его завершении, как правило, между гипсокартоном остаются непривлекательные швы. Сегодня мы поговорим об особенностях и нюансах заделки стыков между гипсокартонными листами.

Необходимость заделки щелей

Чаще всего для укладки гипсокартонных плит предварительно монтируется надежный и крепкий каркас из металла или дерева. Даже если эта конструкция выполнена идеально и в ней присутствует достаточное число необходимых профилей, швы между ГКЛ все равно будут заметны.

Их размер напрямую зависит от состояния кромок облицовочного материала и возможности изменения размеров гипсокартонных листов в условиях температурных перепадов.

Если не заделывать швы, образовавшиеся между панелями, то поверхность гипсокартонной конструкции может стать неровной или казаться таковой – оба варианта нежелательны. Кроме того, покрытие, в котором присутствуют стыки, бросающиеся в глаза, смотрятся неаккуратно.

Как правило, швы между панелями образуются, если обрешетка является недостаточно жесткой

или в конструкции присутствует не так много профилей. Например, под тяжестью гипсокартонных панелей металлические каркасы могут подвергнуться деформации. Из-за этого края плит начинают неравномерно выдаваться.

Также некрасивые швы между панелями могут образоваться из-за утраты линейных размеров конструкции. Подобные явления чаще всего происходят из-за температурных изменений. Минимальные сдвиги листов в таком случае могут привести к растрескиванию материала. Без заделки швов облицовочный материал быстро придет в негодность, поскольку его края будут подвергаться прямому воздействию внешних факторов – впитывать влагу или пересыхать.

Также следует учитывать, что без отделки стыков на поверхности окрашенного или оклеенного обоями гипсокартона будут проявляться некрасивые пятна. Со временем отделочные материалы и вовсе могут отсоединиться от такого основания.

Чем можно воспользоваться?

Стыки между гипсокартонными плитами можно заделывать разными материалами.

Рассмотрим подробно самые распространенные из них.

Бумажная лента

Этот материал продается в рулонах. Длина ленты чаще всего составляет 50, 76 или 153 м, ширина – 52 мм. Такие материалы производятся из специальной бумаги, отличающейся повышенной прочностью. Она армирована стекловолокном и в продольном, и в поперечном направлениях. Как правило, поверхность бумажной ленты отличается шероховатой фактурой, обеспечивающей более качественное и надежное сцепление со шпаклевкой на гипсе.

На бумажной ленте присутствует особая вдавленная вставка, расположенная в центре. Благодаря этому элементу, пользоваться подобным материалом очень легко и удобно. Кроме того, бумажная лента прекрасно подойдет для того, чтобы заделывать участки в углах конструкции. Подобный материал не подвержен растягиванию и смятию, в отличие от простого малярного скотча.

Конечно, бумажная лента не является идеальным материалом. Ей присущи и свои слабые стороны. К ним можно отнести достаточно трудоемкий процесс установки, особенно если сравнивать его с монтажом обычной серпянки. Такой материал подвержен образованию пузырьков воздуха, если на основе лежит недостаточно плотный слой шпаклевки.

Чтобы избежать таких недочетов, рекомендуется приобретать перфорированную ленту. Под ней гораздо реже образуются пузыри.

Самоклеящаяся серпянка

Чаще всего при заделке швов между гипсокартоном мастера пользуются серпянкой. Она реализуется в рулонах шириной 45 и 50 мм, длиной – 20, 45 и 90 м. Самоклеящаяся серпянка идеально подходит для заделки стыков между гипсокартонными панелями, имеющими утоненную кромку. Кроме того, этот материал можно использовать, чтобы заделать трещины на основе или маленькие отверстия. В настоящее время в магазинах можно повстречать много вариантов качественной и прочной серпянки, которую очень сложно надорвать.

Такая сетка бывает:

  • самоклеящаяся;
  • не самоклеящаяся.

Последний продукт является более доступным по стоимости, но его укладка отличается трудоемкостью.

Используя самоклеящуюся серпянку, необходимо брать в учет одну важную деталь: уже начатый рулон такого материала следует хранить только в полиэтиленовом пакете, чтобы клейкий слой не пересох и не утратил своих свойств.

Шпаклевка

Это еще один важный компонент, необходимый для заделки гипсокартонных швов. Специалисты рекомендуют замазать стыки высококачественной шпатлевкой, которая не дает усадки и не подвергается растрескиванию с течением времени. Кроме того, шпатлевочная смесь должна образовывать гладкую и прочную поверхность на гипсовом основании. Подобным требованиям отвечают фирменные составы, выпускаемые брендом Knauf.

Грунтовка

Такой состав необходим, чтобы защитить материал от плесени и грибка. Кроме того, гипсокартон, покрытый грунтом, не так боится контактов с влагой. Как правило, грунтовка наносится на основу в 2 слоя.

Штукатурка

Штукатурка служит в качестве финишного покрытия, создающего идеально ровную и аккуратную поверхность. Кроме того, штукатурная смесь способна обеспечить гипсокартону дополнительную защиту и высокую адгезию со следующими наносимыми покрытиями.

Необходимые инструменты

Прежде чем приступать к заделке швов между гипсокартоном, необходимо подготовить некоторые инструменты и приспособления:

  • Набор шпателей. Специалисты рекомендуют покупать три основных инструмента – широкий, узкий и средний. Широким приспособлением вы будете пользоваться меньше всего, зато с его помощью можно очень легко и быстро разгладить швы.
  • Сокол. Данный инструмент не является обязательным к приобретению, однако, многие мастера пользуются им очень часто. Сокол представляет собой специальное приспособление для работы со шпаклевочной смесью. Он состоит из плоской пластины и рукоятки.
  • Уровень. Специалисты рекомендуют выбирать между лазерным и пузырьковым инструментом.
  • Для шпаклевки стен можно приобрести или взять напрокат специальную машинку.
  • Дрель с насадкой-миксер.
  • Кисть и валик для грунтовочного раствора.
  • Чистый брусок.
  • Наждачная бумага.
  • Специальный строительный нож.

Покупайте только качественные и надежные инструменты известных фирм. Как правило, они имеют высокую цену, зато отличаются надежностью и прочностью, поэтому работать с ними будет гораздо удобнее и эффективнее.

Поэтапное описание процесса

Если вы запаслись всеми необходимыми материалами и инструментами, то можете смело переходить к заделке гипсокартонных швов. Рассмотрим подробно, как производятся данные работы.

Подготовительный этап

Гипсокартон должен быть надежно и крепко закреплен на обрешетке. Очистите поверхность основания от грязи и пыли. Если на стыках имеются заусенцы, то их нужно удалить при помощи строительного ножа.

На гипсокартоне и швах не должно быть выступающих элементов и прочих дефектов. Основу можно протереть обычной тряпкой. Однако если конструкция из ГКЛ простояла какое-то время, то ее нужно качественно очистить.

Обязательно проверьте шляпки саморезов.

Многие мастера пренебрегают этим этапом, что в дальнейшем приводит к «спотыканию» шпателя об эти элементы в процессе нанесения раствора. Пройдитесь рукой по местам крепежа. Если на каком-то участке саморез выдается над поверхностью, вы это обязательно заметите. В таких случаях шляпку нужно аккуратно утопить в материале, используя отвертку или шуруповерт.

Заводские кромки листов не нужно подвергать дополнительной обработке. Однако если на ваших материалах имеются стыки прямых торцевых сторон или разрезанных деталей, то их нужно немного подрезать. В месте соединения следует сделать фаску под углом в 45 градусо Парв.аметр ее ширины и глубины должен составлять 5 мм. Резку необходимо проводить при помощи строительного ножика.

Перед непосредственной заделкой швов нужно нанести на гипсокартонную поверхность грунтовочный слой. Если вы купили концентрат, то его следует развести водой в определенных пропорциях, указанных на упаковке. Если же вы запаслись готовой смесью, то ее нужно хорошенько перемешать, а затем нанести на гипсокартон. На данном этапе следует учитывать, что на листах хорошо заметны обработанные плоскости, поэтому весь процесс нужно держать под строгим контролем.

Швы необходимо грунтовать на 15 см по обе стороны от места стыковки.

Заделка швов

К заделке швов можно переходить только после правильной подготовки основы.

  • Стыки следует зашпаклевать с лентой. Раньше технология была немного другой – сначала наносился состав, а потом в него утапливали серпянку. Сегодня все иначе – ленты имеют клейкие покрытия, поэтому их можно аккуратно приклеить к основе. Когда стык между плитами будет заклеен серпянкой, лишний материал нужно удалить при помощи ножа.
  • Прежде чем приступать к шпаклевке стыков, нужно подготовить смесь. Для этого следует взять чистую емкость и налить в нее необходимое количество воды. Затем надо засыпать в нее шпаклевочный состав. Требуемые пропорции, как правило, указываются на фирменной упаковке.
  • Потом компоненты тщательно перемешиваются до получения однородной массы. Для этого рекомендуется использовать дрель с насадкой-миксер. С таким инструментом смесь получится более качественной.
  • Далее нужно взять небольшое количество шпаклевки, положить ее на широкий шпатель узким инструментом. Сначала нужно заполнить швы между листами ГКЛ. Двигайтесь поперек стыка, замазывая углубление, вдавливая в него раствор шпатлевки.
  • Теперь нужно выровнять смесь вдоль стыков таким образом, чтобы углубление шва было заполнено до конца. Для этого нужен шпатель в 200 мм. Что же касается прямых стыков с вырезанной фаской, то для их выравнивания нужно наносить раствор широкими полосами по 150 мм в каждом направлении.
  • Для укрепления углов конструкции рекомендуется наклеивать сетку-серпянку шириной 100 мм. Она защитит материалы от растрескивания. Подобные участки лучше отделывать специальным угловым шпателем. Этот инструмент производится как для внешних, так и для внутренних углов.
  • После высыхания основания его поверхность необходимо выровнять шлифовальным бруском, наждачной бумагой или специальной абразивной сеткой. Если после шлифовки покрытия вы обнаружили на нем какие-либо изъяны, то их нужно заделать и выровнять повторно.

Таким образом вы своими руками подготовите основу под обои или покраску.

Полезные советы

  • Используя самоклеящуюся серпянку, нельзя терять время зря, чтобы не испортить работу. Постепенно откручивайте ленту, прижимая ее к местам соединения гипсокартона или проему, находящемуся между полом и панелью.
  • Специалисты рекомендуют использовать гипсовую штукатурку для таких работ. Такие растворы хороши тем, что позволяют стенам «дышать».
  • Для грунтования гипсокартона лучше использовать акриловый состав, поскольку в фасадных растворах присутствует много вредных веществ.
  • Приклеивая сетку, старайтесь перекрывать крепежные элементы на гипсовой стене.
  • При подготовке шпатлевочной смеси рекомендуется замешивать не более 5 литров за один заход, поскольку она начинает высыхать в ближайшие 30 минут. Из-за этого вам придется просто выбросить затвердевшую шпаклевку, если вы не успеете ее истратить.
  • Если вы используете гипсовую шпаклевку, то вам следует помнить, что она несовместима с такими материалами, как ДСП, керамика или камень.
  • Не рекомендуется для заделки швов использовать масляно-клеевую шпаклевочную смесь, она дает слишком большую усадку.
  • Чтобы все работы были проведены успешно, в окружающем пространстве должна сохраняться температура не ниже 10 градусов. Влажность должна быть в пределах нормы. Защитите помещение от сквозняков.
  • Используйте для работы только высококачественные и фирменные материалы. В противном случае гипсокартонная конструкция прослужит недолго.
  • Для работ нужно воспользоваться чистыми тарой и инструментами, иначе качество шпатлевки может снизиться в разы.
  • Если вы заметили, что возле швов на окрашенном гипсокартоне появились пятна или от основы отходят обои, это означает, что заделка стыков была произведена неправильно и некачественно.

Мастер-класс по заделке швов гипсокартона смотрите далее.

Заделка швов гипсокартона — материалы, рекомендации

Любые ремонтные работы, заключающиеся в отделке помещений, предусматривают использование грунтовки. Для чего нужна грунт..

Читать далее. ..02.10.2021

Все чаще и чаще для выравнивания поверхностей в помещении используется гипсокартон. Недорогая цена и простой монтаж прив..

Читать далее…01.10.2021

Теплоизоляция дома — комплексное мероприятие, которое включает в себя несколько этапов. Чтобы решить, как утеплить дерев..

Читать далее…14.08.2021

Стены в ванной комнате принято облицовывать керамикой. Современная тенденция – класть плитку на гипсокартон, который пом..

Читать далее…30.07.2021

Жилой чердак в частном доме решает множество полезных задач. В процессе эксплуатации необходимость ремонта мансарды возн..

Читать далее…27.07.2021

Плитка применяется для облицовки поверхностей как в помещении, так и на улице, а значит, она будет подвергаться воздейст..

Читать далее…04.06.2021

Хорошо утепленный потолок — залог комфорта во всем доме. Почему же так важно выбрать лучший утеплитель для потолка в час..

Читать далее…30.05.2021

Тысячи квартир в старых и новых постройках, характеризуются перепадами на потолке в местах неточной укладки панелей. Без..

Читать далее…18.04.2021

С появлением строительных смесей для растворов на потребительском рынке процесс ремонта значительно упростился, а качест. .

Читать далее…05.04.2021

Необходимость утепления домов в условиях удорожания расходов на отопление очевидна.Теплоизоляции подвергаются все констр..

Читать далее…01.04.2021

Еще на этапе планирования ремонтных работ в частном домовладении или квартире, расположенной на нижнем этаже, перед влад..

Читать далее…05.01.2021

Отделка гипсокартоном является оптимальным решением для выравнивания стен, она сокращает время ремонта и экономит трудоз..

Читать далее…04.01.2021

Ошибки, допущенные при утеплении фундамента, становятся очевидными только спустя несколько лет. Проникновение влаги сниз..

Читать далее…03.12.2020

Чтобы облицовка плиткой происходила быстро и просто, а результат получился высокого качества, следует уделить пристально..

Читать далее…01.12.2020

Пенополистирольные или пенопластовые материалы входят в число наиболее востребованных утеплителей. Пенопласт легкий, оче..

Читать далее…28.10.2020

Необходимость отделки откосов окон обусловлена тем, что после установки окна между рамой и стеной остаётся большое прост..

Читать далее…26.10.2020

Залогом безукоризненно выполненного ремонта стен и потолков является качественная черновая отделка. Во многих ситуациях ..

Читать далее…23.10.2020

Чердак — трудное место для выполнения теплоизоляционных работ. Не менее 20% теплого воздуха дома утекает, поднимаясь вве..

Читать далее…08.07.2020

Комфортное жилье, требующее минимальных затрат при эксплуатации невозможно построить без применения эффективного утеплит..

Читать далее…31.05.2020

При строительстве зданий решающим фактором оказывается наличие пароизоляции. Комфортное и эффективное утепление невозмож..

Читать далее…29.05.2020

Популярность отделки и обшивки стен и потолков гипсокартоном и возведения перегородок из ГКЛ в современном строительстве. .

Читать далее…11.04.2020

Сделать подвесной потолок из гипсокартона  своими руками или просто обшить его ГКЛ самостоятельно — отличная идея и..

Читать далее…01.03.2020

Штукатурка – это основа, с которой начинается ремонт (капитальный, косметический, евроремонт) любого помещения.  Ва..

Читать далее…23.06.2017

Климатические условия Беларуси подразумевают, что каждый дом или здание в нашей стране необходимо  утеплять. Залог..

Читать далее…19.06.2017

Гипсокартон – экологически чистый материал для выравниваниястен, потолков и полов, возведения перегородок, арок, а . .

Читать далее…19.06.2017

При выборе грунтовки для обработки поверхности перед нанесением краски, шпаклевки, клея или другого отделочного материал..

Читать далее…13.06.2017

Чтобы чистовая отделка радовала аккуратностью и новизной, мало приобрести качественные материалы. Важно провести  в..

Читать далее…13.06.2017

Грунтовка используется для подготовки поверхности стен к финишной отделке, она улучшает сцепляющие свойства поверхности ..

Читать далее…13.06.2017

Грунтовка глубокого проникновения становится первым шагом в проведении отделочных работ. Цель ее применения заключ..

Читать далее…13.06.2017

Краска-грунтовка, краска-грунт или грунтующая краска – строители и профессиональные мастера по ремонту используют любое ..

Читать далее…13.06.2017

Грунтовка Тайфун Мастер заслуживает доверие отечественных профессиональных мастеров и пользуется спросом загранице..

Читать далее…13.06.2017

Эпоксидная грунтовка – это идеальная защита металлических конструкций и изделий от коррозии. Именно поэтому ее наносят ..

Читать далее…13.06.2017

Доступным и незамысловатым материалом для стяжки пола  является цементная. Толщина в основном не превышае..

Читать далее…13.06.2017

Любой современный строительный магазин предлагает широкий выбор видов гипсокартона по составу в разных типоразмерах и от..

Читать далее…13.06.2017

Ни один строительный объект не обходится сегодня без такого материла, как цемент. Сыпучий компонент используется для изг..

Читать далее…07.06.2017

Отделочные работы – это такой этап строительства или ремонта, на котором чаще всего используются выравнивающие и декорат..

Читать далее…07.06.2017

Без гипсокартона сегодня не обходится практически ни один ремонт квартиры или дома.  Универсальность и доступность г..

Читать далее…07.06.2017

Теплоизоляционные свойства базальтовой ваты Rockwool наилучшим образом соответствуют неустойчивому белорусскому кли..

Читать далее…07.06.2017

Современный рынок стройматериалов развивается немного иначе, нежели рынок спроса.  Нет между двумя векторами полног..

Читать далее…07.06.2017

История производства материалов для утепления жилых и нежилых зданий под торговой маркой Rockwool берет свое начало в да..

Читать далее…07.06.2017

Заделка швов между плитами из гипсокартона является обязательным этапом перед финишной отделкой гипсокартонной конструкц. .

Читать далее…07.06.2017

Чердачное пространство или мансардное помещение в современном домостроении редко бывает нежилым. Владельцы домов хотят м..

Читать далее…07.06.2017

С началом кровельных работ всегда возникает много вопросов о качестве составляющих «кровельного пирога» и о целесообразн..

Читать далее…07.06.2017

Стеклообои «паутинка» или стеклохолст состоят из битого стекла и песка. Несмотря на изобилие видов бумажных и флизелинов..

Читать далее…07.06.2017

К покупке гипсокартона (ГКЛ) надо подойти серьезно, т. к. цена на него зависит от способа применения, толщины, условий по..

Читать далее…07.06.2017

В теплоизоляции нуждаются все конструктивные элементы дома: фундамент, стены, кровля, чердачное и мансардное пространств..

Читать далее…07.06.2017

Ремонт в квартире – дело хлопотное и ответственное. Но вместе с окончанием ремонта приходит в дом новая комфортная атм..

Читать далее…07.06.2017

Неважно, какое напольное покрытие будет укладываться на пол, ламинат, штучный паркет, керамическая плитка или линолеум..

Читать далее…07.06.2017

Гипсокартонные системы, предназначение которых – это выравнивание поверхностей или создание перегородок, сам по себе н. .

Читать далее…07.06.2017

Дерево было и по праву остается одним из популярных и востребованных материалов на всех этапах строительства дома, нач..

Читать далее…07.06.2017

Заделка швов гипсокартона: обработка стыков листов

Статья опубликована в подразделе Отделка стен (который является частью раздела Отделка).

Заделка швов гипсокартона — необходимая операция при проведении отделки с помощью ГКЛ. В наши дни большинство владельцев квартир в многоэтажных домах не оставляют балконы и лоджии открытыми, как это делали раньше. Они стеклят их, благо современные технологии позволяют сделать это быстро, качественно и недорого, и выполняют наружную и внутреннюю отделку.

В итоге лоджия или балкон превращаются в еще одно закрытое помещение, который каждый использует по своему усмотрению. Кто-то делает там еще одну комнату. Кто-то мастерскую. А кто-то зимний сад. Но в любом случае стены застекленного балкона требуют отделки.

Для внутренней отделки используют разный материал. И пластик, и дерево. Приходилось видеть, как некоторые хозяева используют керамическую плитку при отделке балконов. Одним из самых популярных отделочных материалов является гипсокартон. Который имеет много преимуществ перед остальными отделочными материалами.

Во-первых, совершенно не важно, в каком состоянии находится стена, и насколько ровной является ее поверхность. Технология установки гипсокартона такова, что все неровности стены выровнять очень просто.

Во-вторых, достаточно смонтировать всего один лист, чтобы захватить большую площадь стены.

В-третьих, между стеной и гипсокартоном имеется небольшое пространство, куда можно уложить любой утеплитель.

Ну и в-четвертых, – на поверхность гипсокартона можно наносить любую декоративную отделку. Просто покрасить. Или наклеить обои. Нанести декоративную штукатурку.

Информация: единственное, чего не любит гипсокартон, это сырости и влажности.

При монтаже листов гипсокартона, как правило, никаких сложностей не возникает. На стену крепят каркас из металла или дерева. Между рейками укладывают утеплитель и при помощи саморезов к каркасу прикрепляют листы гипсокартона.

И вот тут возникает один интересный момент, на котором хочется остановиться отдельно. После того, как листы гипсокартона установлены, между ними остается шов. А если из гипсокартона создавалась какая-либо сложная конструкция, то таких швов будет много.

Перед тем, как приступить к шпаклевке ГКЛ, необходимо, чтобы была выполнена заделка швов гипсокартона. Если прошпаклевать швы просто так, вместе с плоскостью листа, то в дальнейшем в местах швов шпаклевка попросту отойдет, и поверхность не будет смотреться единой.

Любую строительную работу невозможно выполнять без специального инструмента. И заделка швов в ГКЛ – не исключение. Вам понадобится:

  • ведро для шпаклевки
  • дрель
  • миксер
  • набор шпателей;
  • терка
  • набор сеток для терки
  • валик
  • кювета

Из материалов вам понадобится:

  • грунтовка глубокого проникновения
  • шпаклевка
  • бумажная лента для швов
  • сетка для армирования

Прочитайте нашу статью о том, как правильно клеить виниловые обои. Этот отличный отделочный материал подходит и для балкона.

Какой профиль для окон лучше? Разбираемся в одном из наших обзоров.

А про то, как утеплить балкон пенопластом, можно прочитать здесь.

Технология заделки швов между листами гипсокартона несложна. Но определенные тонкости имеются и здесь.

Если вы посмотрите на торцы листов гипсокартона, то однозначно заметите, что они разные. Заводской шов имеет, как правило, округлую форму. Иногда форма может быть плоской, но в любом случае швы гипсокартона в глубину листа как бы вдавлены. А обычные, не обработанные на заводе срезы не покрыты картоном и не вдавлены.

Так вот, те заводские швы, которые картоном покрыты, не трогаем. А обрабатываем срезы, на которых виден гипс, находящийся внутри листа. Сделать это нужно так: берется острый канцелярский нож и под углом 45 градусов срезаются верхние кромки ГКЛ. Получается стык заводского шва и шва с канавкой, которую вырезали вы.

Первым делом необходимо очень тщательно при помощи валика прогрунтовать ГКЛ. Как швы, так и всю поверхность листов. Пока грунтовка сохнет, необходимо приготовить шпаклевку. На сегодняшний день шпаклевок выпускается великое множество. Но наиболее распространенными и популярными являются:

  • Knauf Fugenfuller
  • KREISEL
  • Vetonit Gyproc Siliote
  • SEMIN CE 86

В принципе, между ними практически нет разницы. Но как показывает опыт работы с гипсокартоном, лучше всего себя зарекомендовала шпаклевка для заделки швов SEMIN CE 86. В принципе, можете использовать любую – они все хороши.

Шпаклевку следует высыпать ведро и при помощи миксера довести до нужной кондиции, добавляя воду. Она должна стать похожей на густую сметану. Скорость дрели должна быть минимальной, иначе произойдет разрушение армирующих добавок. Что существенно уменьшит крепость шпаклевки. Следует помнить, что нельзя смешивать старую и новую шпаклевки. Старую следует выработать, а уже потом замешивать новую шпаклевку.

Ну вот, после того, как приготовлена шпаклевка, начинается заделка швов своими руками. Для этого поперек шва наносите раствор. Не просто наносите, а как бы его втираете вглубь шва. Смесь должна заполнить его на всю толщину. На поверхности должна быть избыточная толщина смеси, чтобы она быстро не высыхала, и с ней можно было работать. Таки образом следует заполнить шов по всей его длине. Если длина шва велика, то заделка швов гипсокартона разбивается на несколько этапов.

Если просто нанести шпаклевку в шов, она не будет там держаться. По мере того, как шпаклевка будет высыхать, она уменьшится в объеме и попросту выпадет из шва. Чтобы этого не произошло, шов следует проармировать. Для этого используется специальная бумажная лента для швов или армирующая стекловолоконная сетка.

При покупке армирующей сетки, ее следует проверить на качество. Делается это так: сетку следует подергать на растяжение, посмотреть, как будут сдвигаться ячейки, переломить сетку, и прогладить сверху рукой. Если сетка не лопнула, не растрепалась, то это качественная сетка. Для того чтобы с сеткой было удобно работать, она уже на заводе смотана в рулоны, имеющие разную толщину и длину.

Так вот, на обильно нанесенную шпаклевку в шве сверху накладываете сетку или бумагу. Затем сильным движением шпателя как бы втираем ее в раствор, который нанесли раньше. Таким образом, сетка оказывается в середине слоя раствора, и армирует его, не позволяя сжиматься при высыхании. После того, как сетка утоплена в шов, широким шпателем удаляются излишки шпаклевки.

Если на месте шва возникло утолщение, то следует шпателем выполнить «вытягивание » шва на расстояние 30 см в разные стороны. Все. Теперь шпаклевка должна полностью высохнуть. После того, как полностью высохла шпаклевка на швах, производится шпаклевание поверхности листов гипсокартона.

Шлифовка участков, заделанных шпаклевкой, – это завершающий этап отделки балкона гипсокартоном. Можно для шлифовки использовать обычную наждачную бумагу, но намного удобнее будет пользоваться специальной теркой, в которой устанавливаются специальные сеточки с разным размером ячеек. Работа производится качественно и быстро. Напоминаем, что затирка швов гипсокартона производится только после полного высыхания раствора. Производится затирка круговыми движениями.

Обратите внимание: что при шлифовке производится очень большое количество пыли. Поэтому следует позаботиться о средствах индивидуальной защиты: респиратор или ватно-марлевая повязка.

После того, как выполнена шлифовка, поверхность вновь покрывают грунтовкой. Все. Теперь можно наносить любое декоративное покрытие.

Не знаете как производится расчет металлочерепицы на крышу? Прочитайте об этом в одной из наших статей.

Собираетесь обшивать балкон снаружи? Про то, как производится отделка балкона сайдингом своими руками можно прочитать здесь.

Ниже приводим фотографии по теме статьи «Заделка швов гипсокартона: пошаговая инструкция». Для открытия галереи фотографий достаточно нажать на миниатюру изображения.

Предлагаем вам также ознакомиться с видеосюжетом по теме нашей статьи. В данном видеоролике изложена инструкция о заделке швов гипсокартона.


Понравилась статья? Подписывайтесь на обновления сайта по RSS, или следите за обновлениями:
В Контакте, Facebook, Одноклассники, Google Plus или Twitter.

Подписывайтесь на обновления по E-Mail: 

Расскажите друзьям! Расскажите об этой статье свои друзьям в любимой социальной сети с помощью кнопок в панели слева. Спасибо!

Обсудить статью

Лента соединительная бумажная «Danogips» для заделки швов ГКЛ (рулон 5,2см*76,2м)

Код товара: 123846

В наличии до 130 шт.

Цвет

Белый

Ширина

5,2см

Длина 

76,2м

Преимущества

Имеют самую высокую прочность на растяжение и сдвиг, благодаря чему значительно увеличивается сопротивляемость к появлению трещин, разрывов, искривлений, и составная гипсокартонная стена образует монолит;

Поверхность ленты имеет специальную фактуру для монолитно прочного сцепления со шпатлевкой.

Линия сгиба по центру ленты облегчает отделку угловых стыков;

Для последующей финишной отделки стыка листов гипсокартона достаточно трех минимально тонких слоев шпатлевки 

 

Используйте бумажную соединительную ленту Sheetrock® преимущественно при обработке швов и внутренних углов панелей ГКЛ, ГВЛ. Лента Sheetrock® наносится на универсальную шпатлевку Sheetrock® Fill&Finish Light, либо на специализированную шпатлевку Sheetrock® Taping. Дополнительную прочность углам можно придать с помощью бумажных соединительных лент Sheetrock® с металлическими вставками, либо металлизированных углов на бумажной основе Sheetrock®. Так же бумажная лента может применяться в устройствах для механизированной заделки стыков ГКЛ — Bazooka и Banjo.

Цена указана за 1 шт

Как замазать швы гипсокартона — чтобы они не потрескались

Как сделать чтобы швы на гипсокартоне не трескались.

Если Вы делаете ремонт, наверняка Вас интересует вопрос, как правильно заделать швы гипсокартона. чтобы они не трескались в дальнейшем.


Очень частая проблема, делаете Вы делаете себе ремонт, собрали 2-х или 3-х уровненные потолки, и не успели еще его закончить, как швы на потолках начали трескаться.

 

Очень неприятная ситуация отнимающая много времени сил и нервов на исправление.

Поэтому я хотел бы поделиться с читателями сайта: Полезные самоделки простым способом грамотной заделки швов гипсокартона.

Почему трескаются швы гипсокартона?

Но прежде чем рассказать о том как я заделываю швы ГКЛ, давайте попробуем разобраться почему же эти самые швы трескаются:

Как правило все строители винят в этом усадку дома, однако это не всегда так. Ну а также хотел бы отметить. что трескается не гипсокартон, а шпатлевка между швами гипсокартона.

Основные причины образования трещин на швах гипсокартона

  • Использование слабых профилей и подвесов. (Покупайте профиля толщиной 0,5-0,6 мм, с профилями в 0,3-0,4 мм забудьте про качественную работу)
  • Нарушение технологии заделки швов.
  • Нарушение температурно — влажностного режимов.
  • превышение допустимой нагрузки. связанной с усадкой дома.

Как заделывать швы гипсокартона, чтобы они не трескались

Прежде чем приступить к заделке швов ГКЛ, все мокрые работы в помещении должны быть закончены.

Сама процедура заделки стыков довольно проста:

1) Грунтуем грунтовкой глубокого проникновения швы ГКЛ, или полностью потолок). Дождемся высыхания грунтовки 4-12 часов и приступим к следующему этапу.


2) Замазываем швы шпатлевкой типа: Унифлот, через 1=2 часа проходим вторым слоем при необходимости. Дожидаемя полного высыхания шпатлевки, и приступаем к следующему этапу.

 

3) Теперь мы будем клеить бумажную ленту на клей ПВА.

Отрезаем нужный кусок бумажной ленты, и наносим тонкий слой лея ПВА на ленту и поверхность шва гипсокартона. Клеим ленту, разглаживая и удаляя все пузыри с помощью резинового шпателя.


После высыхания клея, 13-24 часа, убедитесь, что на приклеенной ленте не осталось пузырей, и нет отслоений, теперь можно прошпаклевать потолок обычной шпатлевкой.

 

Если вы сделали все правильно швы ГКЛ трескаться не будут.

Александр Борисов, г. Самара

как правильно и чем заделать швы между гипсокартоном

Практически в любом помещении, где делается ремонт, имеют место работы с гипсокартоном. И здесь немаловажное значение имеет заделка швов между гипсокартонными листами. Выполняя данную работу, большинство людей допускают массу серьезных ошибок и довольно часто вполне осознанных — для экономии времени или с целью большего заработка.

Технология по заделке швов, на первый взгляд, кажется довольно простой, но ее часто применяют так, что полностью теряется весь смысл работ и их результативность.

На сегодняшний день известны четыре эффективных метода заделки шовной линии гипсокартона, которые мы и рассмотрим.

Заделка с помощью армирующей ленты

Это довольно распространенный способ, которым пользуются многие любители самостоятельного ремонта. Заделка швов гипсокартона предусматривает использование только сухих шпатлевочных смесей, которые разводятся водой. Недопустимо применение других материалов, которые дают большую усадку. Такая технология является, по сути, очень простой и даже примитивной.

  • Если стык без фаски: шовные линии между листов гипсокартона тщательно промазываются шпатлевкой. Берется армирующая лента и с прижимом накладывается сверху.

Сразу от себя дополним, что вместо ленты лучше использовать серпянку (самоклеящаяся сетка).

С помощью шпателя ее нужно вдавливать в смесь. Затем, когда все высохнет, поверх нее накладывается шпатлевка, которую после высыхания необходимо затереть затирочной сеткой, или используя шлифмашинку.

  • Если стык с фаской: швы между гипсокартонных листов заполняются шпатлевкой, после чего наносится второй слой. Накладывается и вдавливается сетка, после чего следует дождаться полного высыхания. Затем наносится еще один слой и шлифуется.

Как ни странно, многие начинающие мастера не знают, чем заделываются швы в гипсокартоне, а ведь материалы используются самые элементарные. Заделка швов на стенах ничем не отличается от заделки на потолке.

Изюминка качественной заделки шва заключается в отличном и тщательном наполнении шовного рва шпатлевкой, правильном нанесении серпянки, хорошем вдавливании и полном его высыхании. Если вы плохо вдавили серпянку, то, нанося поверхностный слой шпатлевки, она просто начнет вспучиваться, и ее нужно будет подрезать во многих местах, которые потом придется перешпатлевать.

Подчеркнем: если должным образом не просушен первый слой, сетка будет провисать лохмотьями, которые надо будет убрать. Из всего этого следует вывод, что спешка в данной ситуации может только навредить.

Заделка с применением силиконизированного герметика

Данный метод рекомендован людям, совершенно не знающим, как правильно заделать швы гипсокартона, так как из всех способов этот – наиболее простой.

Первым делом, силиконизированный акриловый герметик вдавливается в стык между листов гипсокартона, и шпателем полностью заполняется. На поверхность кладется серпянка, и затем шовная линия покрывается шпатлевкой.

Заделка по принципу рустов

В стыки между гипсокартонными листами вдавливается монтажная пена. После того как она высохнет, срезаем лишнее, шпатлюем и накладываем сетку. Сушим. Наносим еще один слой, который также просушиваем и шлифуем. Данный метод требует определенных усилий и времени, но он того стоит – швы в гипсокартоне держатся очень прочно.

Грубая заделка

Шовные линии заполняются силиконовым герметиком и после высыхания шпатлюются. Метод простой и быстрый, но существуют определенные риски появления новых трещин.

Возможные ошибки

  1. Одна из самых смешных ошибок заключается в попытках вместо серпянки затолкать бинт и с его помощью заделать шов. При этом бинт во время шпатлевания великолепно мнется, и, соответственно, у горе-шпатлевателя ничего не получается.
  2. Начинающие ремонтники-любители, плохо или вообще не представляющие, чем заделывают швы между гипсокартоном, пробуют наклеивать на них малярную ленту, которую затем пытаются покрасить или зашпатлевать.
  3. Некоторые же из «продвинутых» мастеров пытаются приклеить серпянку без предварительного наполнения шва, она не держится, время идет, и ничего не получается;
  4. А кто-то может показать чудеса изобретательности и применить масляно-клеевую шпатлевку. Только такая обработка дает большую усадку, в результате чего у таких «умников» насмарку идет абсолютно вся работа.

Отделка углов

Распределяем шпатлевку по одной стороне шпателя и потом переносим на любую из сторон угла. Повторяем процесс для второй стороны угла.

Такой метод не допускает излишних расходов шпатлевки.

Для тех, кто задается вопросом, чем лучше заделать швы гипсокартона, расскажем подробнее…

По размеру вырезаем кусок серпянки, который надо сложить пополам и расправить до угла в 90 градусов, затем приложить его к обрабатываемому углу и зашпатлевать. Для заделки внешних углов следует использовать перфорированный уголок, который можно прикрепить с помощью шурупов. Затем с определенной очередностью аккуратно шпатлюются обе стороны угла. Для шлифовки используйте затирочную сетку.

Информация к сведению

Выбор шпатлевки зависит от того, чем в дальнейшем будет обрабатываться поверхность гипсокартона. Если это обои, переживать за незначительные трещинки не стоит, они перекроются обойным клеем и самими обоями.

Покупая шпатель, обратите внимание на его гибкость — с жестким шпателем придется попотеть.

При заделке швов следите за чистотой шпателя, любой из мелких комочков может все испортить.

Инструкция заделки швов в гипсокартоне:

Как заделать стыки, швы между листами ГКЛ

Заделка стыков листов гипсокартона — ответственная процедура, поскольку не правильно заделанные швы между ГКЛ приведут к появлению на них трещин, которые могут испортить весь внешний вид отделки, особенно, если у вас → покрашен гипсокартон (по ссылке можно узнать о покраске ГКЛ без шпаклевания).

Давайте узнаем как и чем заделывать швы между листами ГКЛ своими руками, что бы не образовывались трещины, а если и образовывались, то снизим ущерб от них.

Содержание:
1. Когда трещины между листами ГКЛ опасны.
2. Подготовка швов к заделке (расшивка, грунтовка).
2.2 Формирование широкой фаски по типу заводской.
2.3 Подготовка швов в/на углах.
3. Заделываем углубления и отверстия от саморезов.
4. Чем армировать швы: сетка-серпянка или бумажная лента?
5. Армирование и заделка стыков гипсокартона с помощью бумажной ленты.
5.1 Заделываем шов.
5.2 Клеим ленту.
5.3 Заделываем швы в/на углах.
5.4 Шлифуем, подмазываем.
6. Как и чем заделать резаные стыки гипсокартона.

Когда трещины между листами ГКЛ опасны

Трещины между листами гипсокартона опасны лишь в одном случае — когда гипсокартонная стена покрашена, без обоев. Тогда эти трещины будут видны, и попортят внешний вид отделки.

Трещина на гипсокартонной стене

Если стена подготавливалась под поклейку обоев, то трещины в швах гипсокартона не страшны, поскольку под обоями их не видно, а обои от этого не порвутся — не то натяжение (если, конечно, ГКЛ не смонтирован кое-как и немного даже болтается).

Давайте перейдём к сути вопроса.

Подготовка швов к заделке (расшивка, грунтовка)

Если швы с заводскими краями листов, то расшивать их не требуется, они уже готовы.

Заводской (слева) и обрезные стыки гипсокартона

Если края листов резанные, на них нужно сделать фаску (кромку). Выполняется она либо до монтажа гипсокартона специальным рубанком по ГКЛ, либо после монтажа обычным строительным (канцелярским) ножом со сменными лезвиями 18 мм шириной.

Ножом аккуратно срезаем фаску с краёв ГКЛ под углом 45 градусов

Аккуратно ножом срезаем фаску с 2-х краёв листа «под углом 22,5 градуса на глубину 2/3 листа» — так написано в технологичке от Кнауф, угол в сумме получается 45 градусов. Можно среза́ть под углом около 45 градусов (желательно не больше) на глубину от половины листа. Расшив так все швы грунтуем их грунтом глубокой пропитки как сам шов внутри, так и на расстоянии от него по 5 см по краям, это удобно делать широкой кистью или кистью-макловицей. Оставляем сохнуть. Это не единственный способ расшивки швов, существуют ещё несколько, давайте посмотрим.

Формирование широкой фаски по типу заводской

Сформировать не просто V-образное углубление, а сделать практически заводской шов — задача не из лёгких. Крутые мастера так делают. Зачем? Потому-что при заделке заводского стыка лентой и шпаклёвкой не образуется бугор. А при заделке резанного стыка этот бугор образуется, поскольку нет углубления под армирующую ленту. Этот бугор несколько усложняет дальнейшую работу. При шпаклевании приходится наносить более толстый слой шпаклёвки, чтобы скрыть этот бугор, выводить всю плоскость под этот… бугор. Так же → покраска гипсокартона без шпаклёвки с такими бугристыми стыками практически невозможна, т.к. этот бугор будет выпирать, будет заметен.

И вот тут — кто во что горазд, кто-то просто вырезает фаску ножом.

Формирование фаски с углублением простым ножом

Кто-то подходит к процессу более серьёзно и технологично, создавая для болгарок специальные насадки для фрезеровки ГКЛ, на видео это показано.

В домашних условиях, конечно, такие приспособы ни к чему и если стена из ГКЛ будет шпаклеваться в 2 слоя, то все неровности скроются под шпаклёвкой. На крайний случай можно вырезать фаску ножом, но это не выглядит аккуратно.

Что бы избежать резаных стыков, можно заказывать гипсокартон высотой под потолок, так не нужно будет его подрезать по высоте и стыки останутся максимально заводские.

Подготовка швов в/на углах

Немного особого отношения требуют швы на углах, на стыках листов или со стеной. Так, если у вас стыкуются во внутреннем углу 2 листа, фаску требуется снять только с одного листа, который примыкает ко второму.

Срезаем фаску с одного листа, который примыкает ко второму

Тоже самое касается и стыка, когда лист примыкает к стене (не из ГКЛ), тут так же требуется расшить только лист, со стеной, естественно, ничего делать не требуется, далее, когда мы будем заделывать стык всё будет понятно.

Внешние углы лучше оформлять бумажной лентой (ниже об этом) и поверх неё монтировать уголки — металлические или пластиковые под штукатурку или шпаклёвку. Пластиковые уголки есть такие, которые сразу с сеткой-серпянкой — они тоже неплохие.

Оформление внешнего угла на стыках ГКЛ

Вот так лучше всего оформить внешний угол на стыках листов гипсокартона, НО, под металлическим уголком лучше всего ещё проклеить бумажную ленту для стыков ГКЛ на угол, если поверхность предполагается красить, если под обои, можно и так. Металлические уголки лучше крепить на шпаклёвку/штукатурку, промазывая ей сначала угол, а потом фиксируя уголок. На фото они прикручены на саморезы, что немного портит уголок, его может покорёжить, что скажется на качестве отделки.

Заделываем углубления и отверстия от саморезов

Углубления и места крепления ГКЛ саморезами так же нужно заделать той же шпаклёвкой для стыков. Предварительно необходимо проверить, не выступают-ли саморезы из плоскости, при необходимости подкрутите их, чтобы они были утоплены в лист на 1-3 мм.

Идеально утопленный саморез

Шпаклюем эти места заподлицо с поверхностью.

Чем армировать швы: сетка-серпянка или бумажная лента?

Это не простой вопрос. Большинство просто заделывает швы серпянкой и шпаклёвкой. Но сетка-серпянка не армирует достаточно шов, и он со временем трескается. Такая трещина, как я уже говорил в первом абзаце особо не страшна в случае, когда сама трещина закрыта обоями. Если стена из ГКЛ покрашена, то такая трещина будет видна.

Что же делать? Заделывать, швы между листами гипсокартона лучше всего бумажной лентой для стыков.

Бумажная лента для стыков ГКЛ

Бумажная лента гораздо надёжнее заделывает стыки между листами гипсокартона, с ней практически никогда не образуются трещины, потому-что сама бумага не рвётся, поскольку дополнительно армирована стекловолокном. Точнее, она может порваться, но такого усилия на швах ГКЛ не создаётся. Давайте рассмотрим подробно этот вариант.

Армирование и заделка стыков гипсокартона с помощью бумажной ленты своими руками

Мы расшили швы, прогрунтовали их, грунтовка высохла. Заделывать швы лучше специальной шпаклёвкой для стыков ГКЛ, например Fugenfuller (FUGEN) от Кнауф. Можно применять и обычную штукатурку, замешанную на грунтовке глубокого проникновения, такой способ тоже может подойти, если планируете → шпаклевать гипсокартон, поскольку у штукатурки крупная фракция.

Замешиваем раствор согласно инструкции. Много не нужно, лучше потом ещё раз замешать.

Заделываем шов

Первым делом заделываем сам шов между листами гипсокартона, для этого понадобятся шпатели: один широкий, удобнее пользоваться гладилкой, второй поуже — 15-20 см и 5-7 см, чтобы поменьше заходил в заводской стык, а побольше — наоборот — был шире заводских стыков.

Шпатели: 5-7 см и 15-20 см

Полностью (!) заполняем шов изнутри шпаклёвкой, немного вдавливая её внутрь шва, чтобы шпаклёвка заполнила всё пространство в шве.

Если швов много, можно сделать простую приспособу из пакета из под молока или кондитерского мешка (вариантов много).

Примерно как на фото, мешок или пакет должен быть прочным. Таким способом удобно заполнять швы гипсокартона раствором. Это небольшой лайфхак, продолжим.

Заполняем швы и пространство около них по краям на ширину чуть больше ширины ленты.

Заполняем сам шов и пространство около шва на ширину ленты

Клеим ленту

Далее отматываем ленту от рулона на длину шва, отрезаем (отрываем). Проклеиваем лентой шов строго по центру и прижимаем шпателем, приклеивая ленту к шву, выдавливая шпаклёвку из под ленты, что бы не образовывалось пустот с воздухом. Клеим шершавой (пупырчатой, внутренней) стороной ленты к ГКЛ. Делаем по одному шву за раз.

Приклеиваем малярную ленту на стыки ГКЛ

Малым шпателем проходим по всей длине стыка/ленты, немного вдавливая ленту в шов. Далее, когда лента приклеена, широким шпателем зашпаклёвываем стык в заподлицо с поверхностью.

Лента должна находиться внутри слоя шпаклёвки

На резаных стыках в заподлицо зашпаклевать не получится, там образуется бугор, который скроется только при → шпаклёвке гипсокартона (по ссылке рассказано как шпаклевать гипсокартон).

Заделываем швы в/на углах

Всё примерно так же, только лента клеится на угол, она имеет специальный сгиб по середине, благодаря которому удобно заделывать углы.

После подсыхания клея наружный угол оформляем мет. уголком, как рассказано выше. Или пластиковым, можно с сеткой-серпянкой. Для внутреннего угла достаточно шпаклёвки, аккуратно выводя угол шпателем.

Заделываем внутренний угол той же лентой и шпаклёвкой

Шлифуем, подмазываем

После подсыхания шва, обычно на следующий день, обычно требуется зашпаклевать шов ещё раз, поскольку шпаклёвка имеет свойство втягиваться, усаживаться.

Далее, когда все наши слои высохли, шлифуем ошпаклёванные поверхности наждачной бумагой с мелким зерном или абразивной сеткой (40-60). При необходимости подшпаклёвываем в нужных местах.

Как и чем заделать резаные стыки гипсокартона

Как уже говорилось, заделывая резаные края гипсокартона лентой на этом месте образуется бугор. Можно заделывать такие стыки полосками стеклохолста, который гораздо тоньше и который не вздувается от намокания. Один из минусов бумажной ленты — при намокании она может вздуться, но уложенная внутрь шва, не вздуется, чего не скажешь о резаных швах. По-этому на резаных швах целесообразнее применять полоски стеклохолста.

Швы с резаными краями ГКЛ лучше заделывать стеклохолстом

Вот и всё, наши стыки готовы к дальнейшей отделке и не потрескаются! В идеале гипсокартон после заделки стыков можно проклеить стеклохолстом по всей площади, так уж точно ничего не треснет, и, к тому же, поверхность получится однородной, что хорошо при покраске. Но и вышеописанного способа вполне достаточно для качественной заделки стыков ГКЛ.

Оставляйте ваши советы и комментарии ниже. Подписывайтесь на новостную рассылку. Успехов вам, и добра вашей семье!

A Реверсивно запечатанная, легкодоступная, модульная (SEAM) микрофлюидная архитектура для создания тканевых интерфейсов in vitro

Образец цитирования: Abhyankar VV, Wu M, Koh CY, Hatch AV (2016) A Реверсивно запечатанный, легкий доступ, модульный (SEAM ) Микрожидкостная архитектура для создания интерфейсов In vitro с тканями . PLoS ONE 11 (5): e0156341. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156341

Редактор: Дэвид Т. Эддингтон, Иллинойский университет в Чикаго, США

Поступила: 26 октября 2015 г .; Принято к печати: 12 мая 2016 г .; Опубликовано: 26 мая 2016 г.

Авторские права: © 2016 Abhyankar et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Эта работа финансировалась Лабораторией исследований и разработок (LDRD) в Sandia National Laboratories и Объединенным научно-техническим отделом химической и биологической защиты Агентства по уменьшению угрозы обороны (номер IAA DTRA 10027IA-3167).CK была поддержана грантом NIAID R01AI98853. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Микрожидкостные барьерные ткани (MBT) — это усовершенствованные модели культур in vitro , которые сочетают в себе методы микротехники с живыми клетками, чтобы помочь удовлетворить потребность в биологически репрезентативных анализах для изучения сложных биологических взаимодействий [1,2].Типичные МБТ представляют собой монолитные полимерные структуры, состоящие из синтетических микропористых культуральных мембран, необратимо герметизированных между сетками эластомерных микрофлюидных каналов; индивидуально адресуемые каналы над и под суспендированной культуральной мембраной обеспечивают превосходный контроль над биофизическими / биохимическими микроокружениями и способствуют развитию поляризованных совместно культивируемых популяций клеток в пределах архитектуры. Недавно микрофлюидные подходы были использованы для создания барьерных моделей сосудистой сети, легких, гематоэнцефалического барьера, кишечника, почек и печени [3].Эти системы расширяют возможности традиционных моделей барьеров, таких как анализ Transwell, и открывают новые возможности для исследований, позволяя получать количественные данные на уровне клеток и тканей, включая жизнеспособность; метаболическая активность; токсичность; барьерная проницаемость; клеточная миграция; и экспрессия поверхностного белка в определенных средах культивирования. [4–7]. Несмотря на то, что MBT предоставили важную биологическую информацию, их может быть трудно реализовать в лабораториях без собственных инженерных знаний.В частности, могут быть затруднены процессы, связанные с эффективным посевом клеток, поддержанием культуры и доступом к клеткам для последующего анализа. Цель представленной здесь работы — представить новый подход, который включает специализированные готовые микрожидкостные модули, чтобы помочь упростить и упростить экспериментальные рабочие процессы.

MBT

требуют эффективного связывания между эластомерными каналами и суспендированными культуральными мембранами для достижения определенной апикальной и базолатеральной среды культивирования.В обычных методах склеивания используются адгезивные клеи или обработка кислородной плазмой для подготовки поверхностей к постоянному креплению. Хотя мембраны биологических культур очень эффективны в прикреплении полимеров к полимерам, их трудно включить из-за проблем, связанных с формированием герметичных уплотнений между полимерными микрожидкостными каналами и гидратированными материалами [8,9]. Постоянно запечатанные конструкции также представляют потенциальные проблемы для эффективного введения клеток на поверхность культуральной мембраны и могут потребовать значительных манипуляций и манипуляций с жидкостями для сбора клеток и лизата из системы для последующего анализа.Несколько групп представили альтернативные методы прикрепления микроканалов, включая внешние вакуумные / магнитные коллекторы или схемы механического присоединения, для сжатия жидкостных каналов против растущих слоев клеток или плоских субстратов для создания уплотнений в гидратированной среде [10]. Однако эти подходы с большим форм-фактором могут быть дорогими в производстве для одноразового использования и могут потребовать использования сложного периферийного оборудования.

С картированием генома человека и достижениями в биоинформатике геномика стала мощным подходом к исследованию действий, которые происходят перед экспрессией белка [11].Например, считывание генов может определить, может ли лекарство-кандидат специфично взаимодействовать с целевыми сигнальными путями, или направить разработку медицинских контрмер, механически исследуя взаимодействия хозяин-патоген [12]. Несмотря на то, что протоколы выделения нуклеиновых кислот хорошо известны в рамках традиционных микрожидкостных платформ «лаборатория на чипе» [13,14], надежное выделение РНК, необходимое для анализа, трудно достичь с помощью существующих платформ MBT. Проблема, вероятно, связана с неизбежными потерями пробы, которые происходят на пути прохождения жидкости во время сбора лизата из-за мертвых объемов и транспортировки по каналам с высоким отношением площади поверхности к объему [15].Альтернативные методы выделения РНК с уменьшенным количеством этапов обработки образцов могут значительно упростить сбор нуклеиновых кислот и помочь обеспечить легкий доступ к показаниям уровня генов из мембранных микрофлюидных систем.

Микрожидкостное сообщество прилагает значительные усилия для создания простых в использовании систем, которые улучшат их принятие исследователями биологических наук за счет ограничения потребности во внешних насосах и других инструментах [16], [17]. Здесь мы сосредоточены на разработке удобного рабочего процесса, чтобы упростить эксперимент и ввести новые возможности.Наша масштабируемая, легкодоступная модульная (SEAM) платформа состоит из предварительно изготовленных микрожидкостных модулей, которые обеспечивают: i) точный посев клеток; ii) облегчить интеграцию гидратированных культуральных мембран биоматериала; iii) поддерживать надежное выделение нуклеиновых кислот; и iv) способствовать многоуровневому экспериментальному считыванию данных. В качестве доказательства концепции мы используем SEAM для проверки маркеров поверхностных белков, связанных с воспалением, и показаний экспрессии генов из первичных эндотелиальных клеток микрососудов человека (HMVEC) после апикальной стимуляции липополисахаридом бактериального эндотоксина (LPS).Мы также демонстрируем совместимость SEAM с гидратированными материалами интерфейса культур путем включения самосборной подвешенной мембраны со специфическим для мозга модулем Юнга с использованием магнитной фиксации.

Материалы и методы

Для достижения «дружественного к пользователю» подхода к установлению и анализу границ раздела тканей мы разработали архитектуру SEAM, состоящую из специализированных модулей, с использованием метода лабораторного прототипирования, сочетающего мягкую литографию, лазерную обработку и ламинирование. Как показано на рис. 1а, культуральный модуль состоит из: i) вырезаемых лазером слоев корпуса из ПММА (толщина ПММА 1.5875 мм (1/16 дюйма), McMaster Carr, VersaLaser 40W CO 2 лазер, Universal Laser Systems) со встроенными магнитами из редкоземельных элементов (K&J Magnetics), ii) формованными микроканалами PDMS и iii) съемной вставкой для культивирования клеток.

Рис. 1.

a) Схематическое изображение архитектуры SEAM, состоящей из корпусов из ПММА со встроенными магнитами, каналов PDMS и съемной вставки для культивирования клеток. б) Изображения съемных культуральных вкладышей, включая пористые протравленные дорожки (вверху) и мягкие самособирающиеся (внизу) области культуры.Масштабная линейка = 1 мм. c) Собранный культуральный модуль SEAM с верхним и нижним микрожидкостными каналами, заполненными красными и синими красителями, чтобы продемонстрировать отдельные жидкостные компартменты в магнитозащищенной архитектуре.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156341.g001

PMMA Корпуса и магнитные защелки

Жесткие слои корпуса из пластика были сконструированы путем ламинирования двух вырезанных лазером кусков ПММА (базовый слой: 18 мм x 22 мм и полость: 18 мм x 22 мм с вырезом 7 мм x 11 мм) с использованием самоклеящихся листов (Fralock).Каждый слой корпуса содержал магниты из редкоземельных элементов (диаметром 2,54 мм), ориентированные так, что верхний и нижний корпуса имели противоположные магнитные полюса, обращенные друг к другу. Полости были спроектированы для приема каналов, содержащих PDMS, как описано ниже.

Изготовление каналов PDMS

Полидиметилсилоксановые микроканалы (PDMS, Sylgard 184) (h = 0,25 мм, w = 1 мм, l = 9 мм) были изготовлены с использованием стандартных методов формования реплик с мягкой литографией [18]. Вкратце, УФ-реактивный фоторезист SU-8 100 (MicroChem) был нанесен методом центрифугирования на силиконовую пластину, подвергнут мягкому запеканию и затем подвергнут УФ-свету через прозрачную маску высокой плотности (Fineline Imaging, Inc.) для определения характеристик канала. Затем пластину погружали в раствор проявителя (MicroChem), чтобы удалить несшитый SU-8, и подвергали твердому спеканию, чтобы установить «мастер», используемый для создания микрофлюидных каналов. Для получения блоков PDMS определенной общей высоты мастер помещался в полость формы, состоящую из кольца из ПММА (внешний диаметр = 250 мм, внутренний диаметр = 200 мм), прикрепленного к диску из ПММА (диаметр = 300 мм) с помощью самоклеящегося клея. (Фралок). Затем полость формы была заполнена дегазированным форполимером ПДМС (соотношение основания и катализатора 10: 1).Лист прозрачного майлара был помещен поверх заполненной формы для создания плоской верхней поверхности и покрыт дополнительным кольцом из ПММА (диаметр = 300 мм). Собранную форму зажимали и помещали в печь на 6 часов при 65 ° C. Полученный блок PDMS (с общей высотой 1,7 мм) был извлечен из формы и разрезан до размера (7 мм × 11 мм) с помощью лезвия бритвы. Порты доступа заполняли сердцевиной с использованием пробойника для биопсии 1 мм (Miltex). Блоки PDMS вставлялись в верхний и нижний корпуса из ПММА, при этом канальные элементы были ориентированы внутрь устройства.

Вкладыши для клеточных культур

Как показано на рис. 1а, магнитная фиксация позволяет культуральным мембранам быть зажатыми между жидкостными каналами и запаять их на месте для поддержки разделенных (апикальных / базолатеральных) культур. Мы продемонстрировали использование двух материалов для культивирования клеток: i) стандартной микропористой культуральной мембраны с протравленной дорожкой и ii) гидратированной самособирающейся культуральной мембраны, чтобы подчеркнуть гибкость подхода с магнитной герметизацией (см. Рис. 1b). Гидратированная подвешенная мембрана представляет собой материал, который трудно включить в модели MBT из-за вышеупомянутой несовместимости склеивания.Культуральная мембрана из полиэстера (диаметр пор 0,4 мкм, м, Sterlitech) была вырезана лазером, зажата и ламинирована между двумя листами полиэтилена (PE), вырезанными лазером, содержащими открытую центральную область и чувствительный к давлению силиконовый клей на одной стороне (Fralock ). Непористый полиэтилен изолировал жидкие компартменты и гарантировал, что сообщение между каналами происходит только через нанопористую культуральную мембрану. Листы PE также позволяли легко переносить культуральную вставку между специализированными модулями.

Для культуральной вставки, которая включала гидратированный материал, листы полиэтилена и пористые мембраны (0,1 мкм, мкм, Steriletch) были вырезаны лазером для создания открытых центральных областей. Нанопористая мембрана с трековым травлением была расположена так, что небольшой край выходил в открытую область. Мы адаптировали жидко-жидкую супрамолекулярную химию самосборки, впервые предложенную Ступпом [19–21], для создания водопроницаемой культуральной мембраны, которая прикреплена к вставке носителя. Резервуар PDMS был заполнен 2% -ным (масс. / Об.) Раствором гиалуроновой кислоты (HA) в ацетатном буфере (pH 5.7, 50 мМ), а сверху помещали культуральную вставку. Второй резервуар для PDMS помещали поверх вставки и заполняли 3% -ным (масс. / Об.) Раствором пептидного амфифила (PA) в ацетатном буфере (pH 5,7, 50 мМ). Структура PA содержала хвост пальмитиновой кислоты, последовательность формирования бета-листа и заряженную головную группу (C 16 V 3 A 3 K 3 ). HA представляет собой отрицательно заряженный линейный полимер с большой молекулярной массой, который присутствует в большом количестве во внеклеточном матриксе млекопитающих. Структуры показаны на S1 Рис.Когда растворы вступили в контакт друг с другом, на границе жидкость-жидкость мгновенно образовалась твердая мембрана в результате процесса самосборки, вызванного гидрофобным коллапсом хвостов пальмитиновой кислоты и экранированием заряда между положительно заряженными головками PA и отрицательно заряженными HA. Толщина мембраны может регулироваться в зависимости от времени контакта жидкость-жидкость [22,23].

После самосборки мембраны осторожно промывали PBS (10 мМ фосфат натрия, 150 мМ хлорид натрия, pH 7.4). Затем мембраны устанавливали на очищенное покровное стекло в ячейке для жидкости, заполненной PBS. Модуль Юнга для мембраны был извлечен из графика отклонения кантилевера в зависимости от смещения путем подгонки данных к уравнению сферического контакта Герца с использованием предварительно откалиброванного кантилевера АСМ, модифицированного сферическим зондом 0,005 мм, как описано Soofi [24]. Толщина мембраны определялась методом АСМ в контактном режиме с использованием зонда из нитрида кремния с размером острия 27 ± нм и высотой 800 нм (Новоскан).Данные были экспортированы в NanoScope Analysis (Bruker) для анализа в Origin Pro (Origin Labs). Отсечение молекулярной массы мембраны определяли путем измерения транспорта флуоресцентно меченых декстранов, приобретенных у Sigma (10 кДа, 40 кДа, 70 кДа, 120 кДа, 150 кДа) через мембрану за 24 часа. Характеристики приведены на рис. S2

.

Сборка

Силы притяжения между магнитами в каждом слое корпуса герметизировали каналы PDMS относительно культуральной вставки и устанавливали непроницаемое для жидкости уплотнение, способное выдерживать приложенное давление ~ 35 кПа.Собранная платформа для культивирования SEAM с использованием вставки протравленной культуральной мембраны показана на рис. 1c с красным красителем (верхний канал) и синим красителем (нижний канал), используемыми для идентификации отдельных компартментов. Каждый канал можно отдельно перфузировать клеточной средой для поддержания культуры или введения экспериментального тестируемого соединения (например, лекарства, вируса или токсина окружающей среды). Магнитный фиксирующий механизм позволял вводить и извлекать несущую вставку (и прикрепленные ячейки) из модулей SEAM и обрабатывать их независимо от гидравлической сети.Как показано на видео S1, процесс магнитной фиксации и герметизации культуральной вставки может легко выполнить трехлетний доброволец.

Модуль прямого посева

Как показано на рис. 2а, магнитная фиксация позволила обратимо запечатать несущую вставку в двухкомпонентном посевном модуле ПММА, где клетки были непосредственно введены в область культивирования (площадь поверхности = 0,05 см. 2 ).

Рис. 2.

a) Схема и собранный посевной модуль, состоящий из верхнего и нижнего слоев корпуса и магнитоуплотненной культуральной вставки.В собранном модуле (справа) нижний канал был заполнен желтым красителем, а область добавления ячеек открытого доступа заполнена синим красителем для облегчения визуализации. б) Рабочий процесс (шаги 1–4) для создания границ раздела совместно культивируемых тканей. Желаемое количество клеток добавляли в культуральную область вставки и давали возможность прикрепиться. Затем вставка была отсоединена от корпусов из ПММА, перевернута, повторно запечатана и засеяна второй совокупностью. c) Репрезентативное изображение совместно культивированного первичного альвеолярного эпителия человека, окрашенного на окклюдин (зеленый), и первичного эндотелия микрососудов человека, окрашенного на VE-кадгерин (красный), оба с ядерным контрастом (синий).Масштабные линейки = 40 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156341.g002

В процессе изготовления использовались процессы лазерной резки и ламинирования, описанные для модуля культивирования. Модуль прямого посева состоял из верхнего корпуса из ПММА со встроенными магнитами, отверстий для доступа и центрального резервуара. Лист PDMS, вырезанный лазером (0,125 мм, Interstate Specialty Products), был прикреплен к дну с помощью чувствительного к давлению клея (0,050 мм, Fralock), чтобы способствовать формированию герметичного уплотнения вокруг культуральной вставки во время магнитного сжатия.Нижний корпус из ПММА содержал магниты, канал для жидкости и вырезанный лазером лист из ПДМС, определяющий порты доступа для жидкости. Культуральную мембрану выровняли на нижнем слое над центральным портом доступа, и корпуса были соединены магнитом. Нижний канал и верхний резервуар были заполнены культуральной средой для поддержки прикрепления клеток, и желаемое количество клеток было добавлено непосредственно в культуральную область вставки-носителя. Посевной модуль инкубировали в течение 4–6 часов до прилипания клеток к культуральной мембране.Для совместного культивирования корпуса из ПММА с магнитной защелкой были разделены, а мембрана была перевернута и повторно запечатана между корпусами. Нижний канал был заполнен соответствующей культуральной средой для поддержки прикрепленной популяции клеток, а затем открытая сторона мембраны была засеяна второй популяцией клеток. После клеточной адгезии вставку (с прикрепленными клетками) можно было перенести в культуральный модуль.

Модуль микроперфузии

Хотя появляются альтернативные методы [25], традиционные микрофлюидные подходы основаны на шприцевых насосах для контроля перфузии среды для поддержания здоровья культуры, обеспечения биомеханической стимуляции и доставки экспериментальных тестируемых соединений.Внешние насосы привлекательны благодаря динамическому контролю, который они обеспечивают, но стоимость оборудования может быть непомерно высокой, а внедрение в инкубируемой среде может быть проблематичным. Чтобы предоставить удобный вариант перфузии жидкости для поддержки простого роста клеток, мы использовали гравитационный перфузионный модуль, состоящий из горизонтально ориентированных резервуаров, заполненных жидкостью, разделенных определенной высотой. В типичных гравитационных подходах с вертикально ориентированными резервуарами разница в высоте жидкости между свободными поверхностями жидкости создает перепад гидростатического давления, Δ P = ρ г Δ z, который уменьшается как разница, Δ z , между уровнями жидкости приближается к нулю.Было показано [26], что горизонтальные резервуары поддерживают падение гидравлического давления в подключенной сети микрофлюидных каналов, поскольку Δz остается постоянным, как описано ниже.

Модуль микроперфузии был изготовлен с использованием комбинации лазерной обработки PMMA, чувствительного к давлению клея и ламинирования, описанных ранее; Подход послойного изготовления обеспечил гибкость при проектировании прототипов. Как показано на рис. 3а, слои включали горизонтально ориентированные входные и выходные резервуары для жидкости ( слоев 2 и 5 соответственно с толщиной ПММА = 2.5 мм), слой гидроизоляции, разделяющий резервуары ( слой 3 , h = 1 мм), сеть микрожидкостного сопротивления ( слой 4 , размеры канала: h = 0,02 мм, w = 0,5 мм, L = 25 мм), порты для доступа к входным резервуарам ( слой 1 ) и жидкостное соединение ( слой 6 ) между перфузионным модулем и магнитно связанным культуральным модулем.

Рис. 3.

a) Слои, содержащие перфузионный модуль с гравитационной подачей. б) Вид сбоку подключенных перфузионных и культуральных модулей.Контур жидкости (входной резервуар, aa, через культуральный модуль к выходному резервуару, bb) был осторожно заполнен средой с помощью шприца. c) После заполнения поверхностное натяжение удерживало среду от вытекания из резервуаров, а разница гидростатического давления Δ P вызвала поток жидкости от входного к выходному резервуару.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156341.g003

Как показано на рис. 3b, подключенные перфузионные и культуральные модули были магнитно соединены и осторожно заполнены средой до тех пор, пока каналы не будут заполнены и не появится мениск воздух-жидкость. был установлен в каждом водоеме.Поверхностное натяжение между средой и поверхностями резервуара было достаточным, чтобы жидкость не разлилась в горизонтальной конфигурации, а разница гидростатического давления ( Δ P aa-bb = ρ г Δ z) между входной и выходной резервуары индуцировали поток от aa до bb. Мениск двигался горизонтально, когда жидкость текла по контуру; поскольку не было изменений относительной высоты жидкости в резервуарах ( Δ z), а гравитационное ускорение и плотность жидкости были постоянными, Δ P также были постоянными.Предполагалось, что вклады в поток, связанные с капиллярным давлением, сбалансированы, поскольку входной и выходной резервуары были построены из одних и тех же материалов и имели одинаковые внутренние размеры.

С постоянным перепадом давления ( Δ P aa-bb ) и гидравлическим сопротивлением R в каналах с низким коэффициентом удлинения, определяемыми как [27]: (1)

Средняя скорость потока в сети, Q avg , была рассчитана по выражению Q avg = Δ P R -1 с μ = 0.0007 [Па · сек] при 37 ° C, а w, h, L относятся к ширине, высоте и длине каждого сегмента на пути текучей среды соответственно. В таблице 1 показана взаимосвязь между Δ z и рассчитанной средней скоростью потока в культуральном канале. Расчетная скорость потока в нашей системе (при Δ z = 3,62 мм) составила 2,42 мк л час -1 , что соответствует 58 мкл л, используемым в день (одна полная замена среды в канале культивирования. в час). Новые перфузионные модули использовались в конце каждого периода культивирования.

Соответствующее напряжение сдвига в культуральном канале было рассчитано как 0,00045 дин см. -2 с использованием выражения [28] в уравнении 2, с γ (соотношение сторон культурального канала) = 0,25 [-].

(2)

Среда с контролируемым сдвигом может быть полезна при поддержании культур с использованием чувствительных к сдвигу клеток, таких как нейроны и популяции стволовых клеток [29]. Результаты расчетов напряжения сдвига приведены в таблице 1. Для исследований, где требуются более высокие значения напряжения сдвига, увеличение напора (т.е.е. 15,875 мм или 5/8 дюйма), удалив сеть сопротивления и уменьшив ширину культурального канала до 0,40 мм и высоту до 0,1 мм, можно достичь теоретических касательных напряжений порядка 10 дин см -2 .

В варианте осуществления, показанном здесь, цель перфузионного модуля состояла в том, чтобы продемонстрировать необязательный автономный вариант, способный поддерживать первичные клетки человека в культуре без необходимости использования методов откачки с помощью инструмента. Тем не менее, модульная природа платформы SEAM позволяет при желании реализовать традиционные методы откачки, включая шприцевые насосы (S5 рис., На котором показано подключение к внешнему насосу и взаимосвязь между несколькими модулями культивирования).

Посев клеток

Культуральная вставка была запечатана в посевном модуле, а нижний канал был заполнен соответствующей культуральной средой. Затем в верхний резервуар загружали фибронектин (5 мкл мкг / мл -1 ) и инкубировали (37 ° C при 5% CO 2 ) в течение ночи для покрытия мембраны. Резервуар и канал опорожняли пипеткой, промывали PBS (10 мМ фосфат натрия, 150 мМ хлорид натрия, pH 7,4) и заполняли соответствующей культуральной средой (ScienCell).Первичные HMVEC (ScienCell) размораживали в соответствии с инструкциями производителя и высевали на покрытые фибронектином планшеты для культивирования тканей. После одной субкультуры клетки обрабатывали трипсином и ресуспендировали при концентрации 500000 клеток на мл -1 . 2 мкл л суспензии добавляли в каждую открытую лунку (вход ~ 1000 клеток) посевной платформы непосредственно над областью культивирования сэндвичной культуральной вставки. Клетки визуализировали с помощью инвертированного микроскопа (Olympus IX-70) для обеспечения равномерного покрытия.Затем посевной модуль инкубировали до прилипания клеток к мембране (4-6 часов). Кортикальные нейроны крыс (ScienCell) обрабатывали в соответствии с инструкциями производителя. Из-за хрупкой природы нейронов клетки высевали непосредственно в планшет для культивирования ткани из полистирола, покрытый ГК (Nunc), или на самособирающуюся мембрану при плотности 30 000 клеток на см -2 .

Для совместного культивирования клетки HMVEC засевали, как описано выше. Затем мембрану отсоединили и перевернули.Нижний канал был заполнен средой HMVEC, а посевной резервуар был заполнен культуральной средой легочных альвеолярных эпителиальных клеток (HPAEpiC) (ScienCell). Затем в резервуар добавляли HPAEpiC в концентрации 20 000 клеток на см -2 . Среду меняли дважды в день. После трех дней культивирования клетки на мембране фиксировали и повышали проницаемость для иммуноцитохимии.

Иммуноцитохимия

Клетки фиксировали 4% параформальдегидом (Sigma) в PBS в течение 20 минут с последующей пермеабилизацией 0.1% Triton X-100 в PBS в течение 15 минут. Затем клетки блокировали 2% BSA в PBS в течение 2 часов. Первичные антитела против MAP2 (1: 000, Sigma) или ICAM-1 (1:40, R&D Systems), окклюдина (1: 1000, конъюгированный с Alexa 488, Invitrogen) или кадгерина эндотелия сосудов (VE-Cad, 1:10, R&D Systems) и инкубировали в течение 6–8 часов при 4 ° C. Раствор первичных антител удаляли, клетки осторожно промывали PBS, а затем инкубировали в течение двух часов со вторичными антителами, конъюгированными с Alexa 647 (1: 500, Life Technologies) или Qdot 625 (1: 500, Life technologies).Ядра окрашивали DAPI (Life Technologies) при 15 мкм мкг / мл -1 . 12-битные изображения были получены с помощью программного обеспечения ImagePro на микроскопе Olympus IX-70 с камерой Photometrics CoolSnap HQ2. Настройки экспозиции были выбраны так, чтобы свести к минимуму фоновую флуоресценцию. Обработка изображений производилась в ImageJ, и настройки были применены одинаково ко всем образцам. Мембраны визуализировали непосредственно в устройстве или удаляли и устанавливали на предметные стекла микроскопа, покрывали PBS и закрывали покровным стеклом перед визуализацией.

Генный анализ

Кортикальные нейроны крысы : Культуральные вставки отделяли от культурального модуля стерильными пинцетами и помещали в 150 мкл л RNAzol RT (Центр молекулярных исследований). С этого момента экстракция РНК происходила в соответствии с инструкциями производителя. Клетки лизировали с помощью пипетки и раствор центрифугировали при 12000 g в течение 2 минут. Супернатант помещали в пробирку, свободную от РНКазы, и к раствору добавляли 150 мкл л абсолютного этанола.Смесь встряхивали, затем помещали в колонку Zymo-Spin IIC и центрифугировали при 12000 g в течение одной минуты. Затем колонку промывали и обрабатывали ДНКазой для удаления любых загрязняющих ДНК. РНК элюировали 50 мкл л сверхчистой воды. Качество РНК определяли с помощью набора RNA 6000 на Bioanalyzer (Agilent Technologies). Затем для синтеза кДНК РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием набора для синтеза кДНК iScript (Bio-Rad) в соответствии со спецификациями производителя. Каждую реакцию проводили в дублирующих лунках с генами домашнего хозяйства (GAPDH [5 ‘VIC], ACTB [5’ FAM], RPL13A [5 ‘TET]), детектированными мультиплексно с использованием зондов TaqMan (эндогенные контрольные наборы Applied Biosystems, Life Technologies) в в одной лунке и интересующий ген обнаруживают в другой лунке с использованием мастер-микса SYBR Green PCR (Life Technologies) на CFX96 (Bio-Rad).Гены-мишени включали: Neurodap1, NCAM1, c-fos, trkA (прямой и обратный праймеры, показанные на S3 фиг.). Метод ΔΔ Ct был использован для расчета количества мРНК относительно генов домашнего хозяйства после экспериментальной нормализации фактора лунки. Для каждой биологической реплики проводили две реакции обратной транскрипции с одним контролем без RT. Для каждой сгенерированной кДНК были выполнены три технических повтора с двумя контролями без матрицы. Определение порогового значения Ct с достоверностью 99% определяли путем умножения стандартного отклонения NTC для каждого целевого гена на 6.965. Контрольные эксперименты с использованием РНК из мозга нормальной крысы (Takara Clontech) обрабатывали, как указано выше, для получения данных для сравнения. Данные представляют собой среднее значение со стандартным отклонением.

HMVEC : После стимуляции LPS экстракцию РНК клеток в устройстве проводили с использованием набора Quick RNA Microprep от Zymo (Cat. R1050). Культуральные вставки (и клеточный слой) отделяли от культуральных модулей и немедленно погружали в 600 мкл л ZR-буфера из набора Microprep и центрифугировали для лизирования всех клеток.С этого момента экстракция РНК происходила в соответствии со спецификациями производителя. РНК элюировали 10 мкл л воды, свободной от нуклеаз, и качество РНК определяли с помощью набора Agilent RNA 6000 Pico Kit (Agilent, 5067–1513). Для экстракции РНК из интактных устройств эквивалентный объем (600 мкл л) буфера для лизиса из набора RNA Microprep вручную пипеткой переносили в культуральный модуль и собирали. Собранный раствор затем загружали в колонки для очистки, и экстракция продолжалась в соответствии с указаниями производителя.

Для синтеза кДНК 5 нг РНК из каждого образца использовали для создания кДНК с использованием набора для синтеза кДНК Superscript VILO (Life Technologies, Cat. 11754-050) в условиях, рекомендованных производителем. Для количественной ПЦР 100 нг кДНК использовали в индивидуальных анализах экспрессии гена Taqman (Applied Biosystems). Относительная экспрессия фактора фон Виллебранда (Hs00169795_m1), ICAM-1 (Hs00164932_m1), кадгерина 5 (Hs003_m1), CXCL1 (Hs00236937_m1), CXCL2 (Hs00601975_m1) и CXCL2 (Hs00601975_m1) и CCL4 Δ1401 (Hs002000) была проанализирована с использованием метода 9Δ200034 (Hs002000). GAPDH (Hs99999905_m1) служил в качестве положительного контроля для нормализации, а уровень экспрессии без стимуляции LPS служил в качестве базального уровня.Для каждой сгенерированной кДНК были выполнены три технических повтора с двумя контролями без матрицы. Определение порогового значения Ct с достоверностью 99% определяли путем умножения стандартного отклонения NTC для каждого целевого гена на 6,965.

Результаты

Модульный подход и съемная вставка для культивирования в платформе SEAM позволили использовать рабочие процессы, которые сочетали прямой доступ к клеткам, обеспечиваемый открытыми культурами, с характерными возможностями культивирования, присущими микрожидкостным системам.Как схематично описано в рабочем процессе (рис. 4), культуральные вставки были обратимо соединены с модулями посева для точного микромасштабного посева, затем перенесены в модуль микрожидкостной культуры для исследований культуры клеток и стимуляции LPS с использованием модуля микроперфузии (вариант 1). После стимуляции были получены экспериментальные данные с помощью дифференциальной иммуноцитохимии поверхностных белков или путем отделения культуральной вставки от модуля и передачи ее в коммерческий технологический процесс вне чипа для достижения высококачественного выделения нуклеиновых кислот для последующего анализа.

Рис. 4. Варианты экспериментального рабочего процесса SEAM.

a) Клетки высевают непосредственно в культуральную область желаемой вставки с известной плотностью с использованием модуля посева. б) Культуральная вставка с прикрепленными клетками переносится на платформу для культивирования для долгосрочной перфузионной культуры и исследований воздействия. c) Затем вставку можно напрямую перенести для лизиса вне чипа и выделения нуклеиновой кислоты или d) установить на предметное стекло для визуализации. Клетки также могут быть визуализированы внутри платформы с помощью объектива с большим рабочим расстоянием.e) Модульный подход позволяет легко исследовать комбинацию изображений и ответов на уровне генов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156341.g004

Проверка показаний SEAM с использованием HMVEC, стимулированного LPS

HMVEC выстилают кровеносные сосуды и играют важную роль в обеспечении проницаемости сосудов, регуляции кровотока, заживлении ран и воспалении [30]. Липополисахарид бактериального эндотоксина (ЛПС) является компонентом клеточной стенки грамотрицательных бактерий и часто используется для изучения воспаления.Известно, что ЛПС активирует рецепторы Toll-подобного рецептора 4 (TLR4) на эндотелиальных клетках и индуцирует повышающую регуляцию молекул адгезии на клеточной поверхности, чтобы облегчить арест нейтрофилов [31] и увеличить производство хемокинов для набора и активации дендритных клеток и макрофагов [32]. ]. Мы использовали эту хорошо изученную модель сосудистого воспаления для проверки многоуровневых показаний SEAM, как показано на рис. 5а. Первичные HMVEC высевали на микропористую культуральную область вставки (площадь поверхности = 0,05 см 2 ) с использованием модуля прямого посева.Площадь культуральной поверхности мембраны была выбрана для размещения монослоя контактно ингибированных клеток (~ 20 000 клеток на см — 2 ) с использованием входной популяции в 1000 клеток. 1000 клеток можно было легко и воспроизводимо пипетировать, что помогло снизить стоимость одного анализа. Размер несущей мембраны (7 мм x 11 мм) был разработан таким образом, чтобы она помещалась непосредственно во флакон для выделения клеток в соответствии со стандартным протоколом выделения РНК, при этом ее необходимо было разрезать или манипулировать другими способами.

Рис. 5. Показания SEAM после стимуляции LPS.

a) Для исследования показаний SEAM, имитирующих сосудистое воспаление, эндотелиальные клетки микрососудов человека были засеяны и перенесены в связанные модули культуры и микроперфузии. б) После апикального моделирования с помощью LPS в течение 4 часов клетки окрашивали в канале и мембрану переносили на предметное стекло для исследования экспрессии на поверхности ICAM1 после воздействия стимуляции. Масштабная линейка = 40 мкм. c) Чтобы продемонстрировать быстрое и надежное выделение РНК, вставки были удалены из архитектуры и перенесены на выделение РНК вне кристалла.Статистически значимые (p <0,001) различия в экспрессии мРНК наблюдались в ICAM1, CXCL1, CXCL2 и CCL2, при этом VFW (эндотелиальный маркер) оставался постоянным. SEAM может воспроизводить как экспрессию генов, так и дифференциальные ответы поверхностных белков на стимуляцию ЛПС с помощью простого в использовании рабочего процесса.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156341.g005

После прикрепления клеток культуральную вставку перенесли в культуральный модуль и подключили к модулю микроперфузии на 24 часа культивирования (рис. 5а).Затем перфузионный модуль заменяли новым, и клетки подвергали воздействию LPS через апикальный канал в течение 4 часов, в то время как базальный канал перфузировали культуральной средой. После стимуляции устройства были рандомизированы и отобраны для иммуноцитохимии ICAM-1 или экстракции РНК для последующего анализа экспрессии генов. Разделение и перенос культуральной вставки (с прикрепленными клетками) позволили выделить РНК из всей популяции клеток с использованием оптимизированной коммерческой технологии вне чипа без необходимости обработки жидких образцов.Мы успешно достигли высокого качества выделения РНК (RIN ~ 10, S4 Fig) из небольшой начальной популяции клеток. Клетки, выделенные с использованием внутриканальных методов, также показали высокий RIN (среднее значение = 9,5), но показали вдвое меньший выход РНК (34,1 ± 1,38 нг против 17,3 ± 1,17 нг). Хотя дальнейшие этапы очистки могут противодействовать низкому выходу РНК, метод мембранного переноса значительно упростил процесс и снизил потенциальные источники ошибок за счет исключения этапов обработки образцов. Прямой перенос клеточной популяции предоставляет возможность для рентабельного экспериментального масштабирования и поддерживает методы анализа всего генома, такие как RNA-Seq или miRNA-Seq, которые исследуют глобальные транскриптомные профили без a priori целевой спецификации.

На фиг. 5b и 5c показаны клетки, окрашенные на ICAM-1, и профиль экспрессии гена, отражающий изменения мРНК, вызванные LPS. Значительное увеличение экспрессии мРНК было обнаружено для ICAM-1, CXCL1, CXCL2 и CCL2 (* p <0,001). ICAM-1, молекула поверхностной адгезии, участвующая в остановке свертывания лейкоцитов, была активирована в 2,5 раза, в то время как CXCL1 и CXCL2, хемокины, участвующие в рекрутинге нейтрофилов и лимфоцитов, увеличились в 5 и 11 раз соответственно. Было показано, что CCL2 способствует инфильтрации дендритных клеток и моноцитов, а экспрессия мРНК увеличивается в 6 раз по сравнению с нестимулированным контролем.Уровни мРНК эндотелиального фенотипического маркера фактора фон Виллебранда оставались неизменными, как и ожидалось для здорового контроля. Окрашивание ICAM-1 между стимулированными и нестимулированными клетками продемонстрировало, что изменения мРНК транслировались в изменения уровня белка в системе. Используя автономную платформу SEAM, удалось продемонстрировать изменения уровня мРНК и белка в результате контролируемой стимуляции LPS.

Культивирование нейронов и сравнение экспрессии генов на разных субстратах

Общей целью микромасштабных моделей барьеров in vitro является создание физиологически репрезентативной среды культивирования (например,грамм. биохимические сигналы, механическая стимуляция, межклеточная коммуникация и межклеточные взаимодействия), в которых необходимо изучить реакции на тканевом уровне. Влияние биохимических сигналов и механической стимуляции на микрофлюидные структуры хорошо задокументировано в литературе [33]. Также хорошо установлено, что биофизические взаимодействия между клетками и их субстратом могут влиять на экспрессию генов и управлять фенотипическими изменениями посредством передачи сигналов извне-внутрь [34–37]. Несмотря на то, что был достигнут значительный прогресс в разработке биоматериалов и тканевых каркасов с четко определенными биомиметическими свойствами [38,39], методы приостановки этих границ раздела культур внутри микрофлюидных платформ появлялись медленно.Обратимо запечатанная архитектура, предоставляемая SEAM, может решить эту проблему и обеспечить легкое включение гидратированных интерфейсов культур, чтобы помочь имитировать структуру ткани-мишени.

Например, кора головного мозга или «серое вещество» играет важную роль в нескольких процессах высокого уровня, включая движение и восприятие. ECM мозга имеет уникальный состав с низким процентом фиброзных белков (например, коллагена и фибронектина) и высоким процентом протеогликанов, включая HA [40,41].Чтобы продемонстрировать возможности SEAM, включающие биомиметические мембраны и выделение нуклеиновых кислот, мы количественно оценили различия в уровне генов между клетками коры головного мозга крысы, выращенными на мягком подвешенном биомиметическом интерфейсе HA / PA со специфическим для мозга модулем Юнга (~ 1 кПа), и клетками, выращенными на жесткой пластиковой поверхности с покрытием.

Как показано на рис. 6а, «мягкая» мембрана HA / PA (E ~ 1 кПа) была привязана к несущей вставке с использованием процесса самосборки жидкость-жидкость. После посева и трехдневного культивирования на самособирающейся мембране (внутри культурального модуля) или стандартной пластине для тканевых культур нейроны либо окрашивали на дендритный маркер, MAP2, либо использовали в анализе экспрессии генов для NeuroDap 1, который играет важную роль. в синаптической коммуникации [42]; молекула нейрональной адгезии 1 (NCAM-1), гликопротеин, участвующий в межклеточной адгезии, росте нейритов и пластичности [43]; c-fos — непрямой маркер нейрональной активности [44]; и киназа рецептора тропомиозина A (TrkA), рецептор с высоким сродством к фактору роста нервов (NGF), который активирует факторы транскрипции для контроля передачи сигналов в соме [45,46].Эти мишени мРНК представляют широкий спектр адгезионных белков, рецепторов и показателей нейрональной активности и были выбраны, чтобы помочь оценить потенциальную важность жесткости субстрата с нескольких точек зрения. По сравнению с нейронами, посаженными на жесткие пластиковые субстраты для культур тканей, клетки, культивированные на самособирающейся культуральной мембране, показали интересное сходство с профилями экспрессии генов из РНК, выделенной из ткани мозга крысы (рис. 6b). Включение гидратированных биоматериалов с использованием архитектуры SEAM в сочетании с надежной изоляцией РНК обеспечивает экспериментальные возможности, которые могут помочь повысить актуальность будущих моделей микрофлюидного барьера in vitro , позволяя экспериментально контролировать передачу сигналов извне-внутрь.

Рис. 6.

a) Включение самосборной мембраны в ламинированную несущую вставку. Модуль Юнга мембраны аналогичен мозгу. б) После 3 дней культивирования на мембране SA отдельные мембраны окрашивали на MAP2 (дендридный маркер, масштабная линейка = 40 мкм) и обрабатывали для анализа экспрессии генов. Экспрессия генов Neurodap1, NCAM1, TrkA и c-fos на мягком самоорганизующемся субстрате была ближе к экспрессии генов мозга крысы (пунктирная горизонтальная линия), чем экспрессия генов, выращенных на жестких субстратах.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156341.g006

Обсуждение

Для поддержки удобных для пользователя методов создания, обслуживания и анализа микромасштабных интерфейсов тканей мы разработали автономную платформу, состоящую из съемной вставки для культивирования клеток и отдельных готовых модулей для микрофлюидных операций. Обратимо запечатанная архитектура SEAM позволяет быстро соединять, разъединять и переносить культуральную вставку между модулями для достижения эффективного экспериментального рабочего процесса.Модульный подход также обеспечивает уникальные преимущества, связанные с i) эффективным посевом клеток, ii) простым включением специализированных биологических интерфейсов, iiii) надежной изоляцией нуклеиновых кислот, iv) генерацией многоуровневых считываний и v) упрощенной и удобной работой.

Вставка для культивирования клеток

Концепция съемной вставки для культивирования клеток является ключевым аспектом платформы SEAM. Вставка состояла из микромасштабной пористой области культуры клеток, окруженной непористым носителем, который облегчал перенос и связывание с различными жидкостными модулями.Ламинирование вырезанных лазером полиэтиленовых листов (с клеем, чувствительным к давлению на одной стороне) совместимо с коммерчески доступными микро- и нанопористыми мембранами, которые были оптимизированы для обеспечения низкой автофлуоресценции, высокой оптической прозрачности и определенного распределения пор по размерам. Также могут быть включены такие материалы, как ультратонкие наномембраны [47, 48], коллагеновые пленки [49], листы гидрогеля [50], структурированные субстраты [51, 52], коммерческие продукты EMC [53] и слоистые композитные биоматериалы [54]. для дальнейшей настройки интерфейса культуры, чтобы отразить физиологию ткани.

Традиционные микрофлюидные технологии для постоянного уплотнения мембран между эластомерными каналами в основном используют связывание кислородной плазмой и затрудняют формирование прочных, непроницаемых для жидкости уплотнений при наличии гидратированных материалов. Благодаря концепции магнитной защелки и съемной культуральной вставки материалы для культивирования не обязательно должны быть напрямую совместимы с общим методом изготовления архитектуры. Мы продемонстрировали подход привязки, включающий тонкую самособирающуюся мембрану с модулем Юнга, адаптированным для имитации среды мозга (~ 1 кПа).Этот метод изготовления самосборки мембран жидкость-жидкость на основе интерфейса [55] был выбран потому, что трудно включить этот тип культурального субстрата в микрофлюидную платформу на основе мембран. Включение гидрофильных (полиэфир) и гидратированных мембранных материалов (HA / PA) также сделало возможным простое смачивание и заполнение без модификации поверхности и ограниченного введения и образования пузырьков внутри каналов. В том маловероятном случае, когда наблюдается пузырек, систему можно разобрать, чтобы устранить препятствие.

Наша адаптация самосборной мембраны к культуральной вставке позволяет манипулировать подвешенной мембраной толщиной 900 нанометров на протяжении всего рабочего процесса (например, посев, культивирование, визуализация и выделение нуклеиновых кислот). Тонкие культуральные мембраны могут помочь точно представить динамику межклеточной коммуникации через тканевый интерфейс. Например, паракринные сигнальные факторы, перемещающиеся через культуральную мембрану толщиной 10 мкм, требуют в 100 раз больше времени, чем для мембраны толщиной 900 нм.Некоторые барьерные ткани (включая альвеолярно-капиллярный интерфейс [56] и гематоэнцефалический барьер [57]) содержат слои поляризованных клеток, разделенных субмикрометровыми расстояниями; Возможность включения ультратонких биоматериалов, изготовленных на заказ, дает уникальную возможность воспроизводить физиологические структуры тканей. Мы наблюдали этот феномен в нашем доказательстве принципиальной демонстрации при изучении изменений на уровне генов в нейронах крыс, культивируемых на мягких и жестких интерфейсах. Функциональные последствия этих изменений на уровне генов необходимо изучить более подробно, а архитектура SEAM обеспечивает удобный подход для включения передовых биологических интерфейсов для повышения актуальности анализов in vitro .

Мы обнаружили, что разделение и перенос культуральной вставки позволили выделить высококачественную нуклеиновую кислоту из образцов малых клеток. После экспериментального воздействия вставка (со всей популяцией клеток) была отделена от архитектуры с помощью обратимой магнитной фиксации и перенесена непосредственно в рабочий процесс протокола изоляции вне кристалла. Возможность перемещать всю популяцию клеток без манипуляций помогла ограничить потери образцов, которые неизбежно происходят при транспортировке клеточных лизатов в микрофлюидных каналах с высоким отношением площади поверхности к объему.Используя подход переноса, мы смогли достичь значений RIN, приближающихся к максимальному значению 10 из ~ 1000 входных ячеек. Значения RIN также были высокими при использовании внутриканального лизиса и сбора (среднее значение = 9,5), но приводили к примерно в 2 раза меньшему количеству РНК и сбора по сравнению с методом переноса культуральной вставки. Техника съемной культуральной вставки позволила просто и быстро перенести всю популяцию клеток для выделения РНК, не требуя манипуляций с жидкостью.

Хотя в этой работе мы продемонстрировали дифференциальные показания экспрессии генов, перенос вставки позволяет использовать широкий спектр оптимизированных коммерческих методов, включая анализ для изучения повреждений ДНК, генотоксичности и транскриптомики всего генома (например,грамм. miRNA-Seq или RNA-Seq), которые исследуют паттерны активации глобального пути, возникающие в результате взаимодействия с кандидатом в лекарство или патогеном. Несмотря на то, что хорошо известно, что активация сигнального пути на уровне мРНК не обязательно приводит к экспрессии белка и функциональному ответу, считывание на уровне генов дает важную информацию для выявления потенциально взаимосвязанных путей, которые можно использовать для оценки потенциальной токсичности и определения терапевтических подходов. разработка. Анализы белков на основе КПЦР (например,грамм. TaqMan Protein Assays) можно включить в рабочий процесс для прямой корреляции экспрессии мРНК с уровнями белка и изучения посттрансляционной модификации белка. Кроме того, съемную культуральную вставку можно закрепить на предметном стекле для визуализации с высоким разрешением внутриклеточной локализации и локализации белка на поверхности. Концепция переносной вставки открывает двери для расширенных многоуровневых считываний, которые обеспечивают уникальное понимание того, как ткань взаимодействует с внешним агентом.

Прямой посев клеток

В постоянно герметичных мембранных системах границы раздела тканей устанавливаются путем введения клеток внутрь устройства путем пропускания клеточной суспензии через микрофлюидные каналы, которые находятся в контакте с культуральной мембраной; поток останавливается, и клетки оседают на поверхности мембраны.Процесс седиментации по всей длине канала затрудняет контроль начальной плотности клеток и воспроизводимое введение того же количества клеток в систему. Следует также соблюдать особую осторожность, чтобы предотвратить попадание пузырьков во время процесса введения проточной ячейки. Посев клеток значительно упрощается на традиционных платформах для культивирования открытого формата, таких как чашки Петри и многолуночные планшеты, где клетки непосредственно добавляются на поверхность культуры с помощью наконечника пипетки. Здесь воспроизводится простота открытого посева путем обратимого связывания культуральной вставки в посевном модуле; определенное количество клеток добавляется непосредственно в область культуры через открытый резервуар.Прямой посев может значительно уменьшить количество клеток, необходимых для эксперимента, и позволить использовать редкие или дорогие популяции клеток, включая стволовые клетки, первичные клетки человека и клинически значимые образцы.

Например, типичная микрофлюидная система засеяна примерно 20 000 первичными человеческими клетками с одной стороны мембраны [58]. Для коммерческой первичной популяции клеток человека стоимостью ~ 600 долларов за миллион клеток и при условии, что 100% клеток равномерно доставляются в область культивирования без потери образца, консервативные затраты, связанные с клетками, составляют 12 долларов за анализ.С помощью метода прямого посева ~ 1000 клеток можно ввести непосредственно в определенную область культуры с минимальной потерей образца, поскольку манипуляции с жидкостью не требуются. Соответствующая стоимость, связанная с клетками, снижена до 0,60 доллара за анализ (20-кратное сокращение), что облегчает масштабирование эксперимента и повышает практическую полезность. Поскольку площадь культивирования клеток и количество вводимых клеток известны, поверхностную плотность посева можно быстро оптимизировать в соответствии с потребностями конкретной ткани. Модуль посева также позволяет легко создавать совместные культуры: i) засевая одну сторону области культуры, ii) ожидая прикрепления, и iii) отсоединяя, переворачивая и повторно закрывая вставку перед непосредственным засеиванием другой стороны.После второй фазы прикрепления клеток мембрану можно перенести непосредственно в культуральный модуль.

Микроперфузия и культивирование клеток

Обычные культуральные платформы требуют шприцевых насосов для подачи жидкости через платформу. Стремясь сделать микрофлюидные анализы доступными для широкого круга конечных пользователей, мы разработали вариант модуля с гравитационной подачей, который обеспечивает возможности микроперфузии в нашей автономной системе. Модуль микроперфузии можно использовать для поддержания клеточных культур или воздействия экспериментальных соединений на апикальные или базолатеральные популяции.Каждый резервуар адресуется индивидуально и может использоваться для создания физиологической среды культивирования, такой как культура раздела воздух-жидкость, что актуально в моделях роговицы, кожи и легких. Наша опция перфузии без оборудования также делает платформу пригодной для использования в учреждениях BSL3 / 4, где шприцевые насосы трудно реализовать из-за рисков образования аэрозолей и проблем, связанных с проблемной дезактивацией [59]. Уравнения 1 и 2 используются для оценки дебитов, требуемых объемов коллектора и касательных напряжений.Изменение физических конструктивных параметров (высоты каналов и падения давления) можно легко изменить для достижения желаемых характеристик перфузии. Как показано на дополнительном рис. S5, модульный подход также позволяет напрямую взаимодействовать с шприцевыми насосами или другими насосными механизмами для обеспечения стимуляции сдвига, если это необходимо. В этой демонстрации микрофлюидные каналы были сформированы из PDMS и использованы для герметизации каналов против культуральной вставки при магнитном сжатии и обеспечения разделенной культуральной среды.PDMS имеет несколько благоприятных свойств, включая оптическую прозрачность и простоту изготовления, но у материала также есть хорошо известные проблемы, связанные с разделением небольших гидрофобных молекул на массу [60,61]. В таких ситуациях, как тестирование кандидатов в низкомолекулярные лекарственные препараты, полиуретан может использоваться для минимизации эффектов разделения [62].

Модульное прототипирование и системы нового поколения

Используемый здесь процесс изготовления на основе лазерной резки и ламинирования идеально подходит для итераций дизайна и разработки прототипов; при наличии опыта партию или 5–10 модулей можно разрезать, выровнять и собрать менее чем за пять минут.После завершения дизайна модули можно масштабировать для мелкосерийного производства с использованием методов горячего тиснения или переводить на литье под давлением для крупномасштабного производства. Перечень комбинированных модулей для поддержки экспериментальных исследований может быть создан как на стадии лабораторного прототипа, так и на стадии усовершенствованного прототипа. Таким образом, конечные пользователи могут легко вводить необходимые возможности.

Используемая везде техника магнитной связи также обеспечивает простой подход для соединения различных тканевых модулей вместе (например,грамм. от сердца к легким) через магнитный коллектор для изучения многомодульных взаимодействий лекарств или токсинов (S5, рис.). Экспериментальное масштабирование может быть достигнуто путем подключения нескольких модулей к общему источнику перфузии. Модульный подход также позволяет интегрировать микрожидкостные иммуноанализы в линию с SEAM для анализа секретируемых белков из небольших популяций клеток [63–65], а метод послойного изготовления может поддерживать интеграцию электродов для обеспечения измерений целостности барьера в реальном времени. Архитектура обратимого SEAM обеспечивает технику для изучения многоуровневых считываний клеток, культивируемых на различных субстратах с определенными биохимическими и биомеханическими свойствами.Было показано, что материал HA / PA, используемый в нашей работе, увеличивает ответ на перепад давления на границе раздела [23]; эта возможность может быть использована в будущих исследованиях для внедрения механического растяжения типа «орган на чипе» на границы раздела тканей, поддерживаемых в SEAM. Благодаря недавним достижениям в аддитивном производстве из нескольких материалов, прямая 3D-печать может выйти за рамки простых жестких материалов корпуса и разработать интегрированные жесткие и гибкие элементы, которые можно использовать для обратимого уплотнения мембран клеточных культур общего класса, а также ввести механическую стимуляцию для лучшего имитации физиологическая микросреда без ущерба для простоты использования.

протекающих воздуховодов и вы | Качество воздуха в помещении | HL Bowman

Хотя это скрытый элемент в вашем доме, воздуховоды имеют решающее значение для домашнего комфорта. Это система, с помощью которой теплый или прохладный воздух циркулирует по всему дому. И весь ваш кондиционированный воздух, будь он теплый или охлажденный, должен проходить через эти воздуховоды. Таким образом, очень важно иметь в доме хорошо обслуживаемую систему воздуховодов.

Что такое воздуховоды?

Компания HL Bowman очень серьезно относится к воздуховодам.Наши специалисты по отоплению и охлаждению знают, какую важную роль играют воздуховоды вашего дома во многих сферах — в частности, в вашем комфорте, счетах за электроэнергию и здоровье. Здесь, в Кэмп-Хилле, мы видим разницу между воздуховодами, которые хорошо закрыты и обслуживаются, и воздуховодами, которые не используются регулярно.

Воздуховоды или воздуховоды вашего дома в Пенсильвании — это коридоры, по которым теплый или охлажденный воздух проходит туда и обратно в систему отопления, вентиляции и кондиционирования (HVAC) и к вентиляционным отверстиям в вашем доме.Он состоит из системы воздуховодов и труб, обычно металлических, и имеет швы, которые профессионально герметизируются при первой установке. Некоторые места также могут быть изолированы, чтобы уменьшить потери энергии.

Почему вы не видите свои воздуховоды?

Большая часть ваших воздуховодов скрыта за стенами или в местах, которые не так часто используются, как другие части вашего дома. Скорее всего, вы не увидите его большей части. Часто он находится на чердаке, и для большинства из нас воздуховоды могут попадать в категорию невидимых и неуместных.Но такой образ мышления может поставить под угрозу комфорт в помещении, стоить вам денег и даже повлиять на ваше здоровье.

Зачем герметизировать и изолировать воздуховоды?

Надлежащее уплотнение и изоляция воздуховодов предотвращает утечку очищенного воздуха из системы воздуховодов. По данным Министерства энергетики США, от 20 до 40 процентов энергии теряется в большинстве систем воздуховодов. Воздуховоды обычно изготавливаются из тонкого листового металла или стекловолокна. Ваш циркулирующий воздух может легко просачиваться через эти материалы, а также через любые швы воздуховодов.

Кроме того, изоляция воздуховодов защищает воздуховоды от плесени и роста плесени, потому что прохладный воздух вашего дома проходит через воздуховоды, расположенные в теплых частях вашего дома. Это может вызвать конденсацию в ваших воздуховодах, которая способствует появлению плесени и грибка. Изоляция воздуховодов регулирует температуру и предотвращает этот сценарий.

Зачем нужно обслуживать воздуховоды?

Со временем уплотнения воздуховодов могут ухудшиться и заржаветь, а изоляция может потерять свою эффективность, что и вызовет проблемы.Вот почему так важно, чтобы профессионалы регулярно проверяли вашу систему воздуховодов и устраняли любые утечки.

Плохо обслуживаемый и негерметичный воздуховод может вызвать следующие проблемы:

• Увеличение ваших счетов за отопление и охлаждение

Утечки в ваших воздуховодах могут возникнуть там, где они соединены. Утечка воздуха — это потраченный впустую воздух. Ваша печь или кондиционер израсходовали энергию, за которую вы платите, на нагрев или охлаждение воздуха. Когда этот воздух не попадает в желаемое место в вашем доме, вашему блоку HVAC приходится работать вдвое тяжелее, чтобы восполнить потерянную энергию — это, по сути, выбрасывание денег.

• Негативно влияет на комфорт в помещении

Из-за утечки энергии из ваших воздуховодов ваша внутренняя температура может постоянно меняться и оставлять вас без ожидаемого комфорта. Независимо от того, какой у вас тип системы отопления, вентиляции и кондиционирования (HVAC) и насколько она энергоэффективна, если у вас негерметичные воздуховоды, ваша система не сможет обеспечить вам эффективный уровень комфорта и реализовать свой потенциал.

• Плохое здоровье

Утечки могут привести к попаданию нежелательных веществ из воздуха в в вашу систему воздуховодов, а это означает, что такие загрязнители, как выхлопные газы, дым, окись углерода или многие другие загрязнители, могут попасть в вашу систему воздуховодов и циркулировать по дому, даже если вы об этом не подозреваете.Это может вызвать множество проблем, в том числе вызвать проблемы с дыханием или обострить проблемы, которые у вас могут быть, такие как астма или аллергия.

Позвоните нам сегодня, чтобы проверить систему воздуховодов

Диагностика и устранение проблемы с протекающим воздуховодом — это простой процесс, который значительно улучшит комфорт и здоровье вашего дома в Кэмп-Хилл, штат Пенсильвания. Наши технические специалисты HL Bowman являются экспертами в области воздуховодов, их установки и обслуживания. Позвоните нам по телефону 717-561-1206 или свяжитесь с нами через Интернет, чтобы получить помощь с воздуховодами.

HL-M810 Горизонтальный герметик из нержавеющей стали с кодировкой сухих чернил

ВРЕМЯ ПОСТАВКИ

Мы стремимся выполнять заказы как можно быстрее. Большинство наших заказов обрабатываются и отправляются в течение 24-48 часов. Однако обработка и отправка некоторых товаров занимает больше времени. Мы приветствуем покупателей, которые обращаются к нам, чтобы уточнить наличие на складе и время выполнения заказа.Мы отправляем товары напрямую от их производителя. Во многих случаях продукт будет доставлен вам напрямую от производителя. В некоторых случаях мы можем отправить товар на наш склад перед отправкой вам. Любая ускоренная доставка (3-дневная, 2-дневная, в ночное время) не может повлиять на время обработки заказа, поэтому, пожалуйста, сделайте скидку перед размещением заказов.

Мы используем UPS в качестве основной службы доставки, однако могут быть запрошены другие перевозчики (например, FedEx, USPS, многие распространенные перевозчики). Хотя мы стремимся удовлетворить ваши запросы, мы оставляем за собой право при необходимости изменить перевозчика.


БЕСПЛАТНАЯ ДОСТАВКА

Для некоторых наших товаров предусмотрена бесплатная доставка. Обратите внимание, что мы оставляем за собой право прекратить, изменить или отозвать условия этого предложения. Бесплатная доставка распространяется только на наземное обслуживание и не включает доставку в субботу, лифт и внутреннюю доставку. Бесплатная доставка предлагается только для заказов до 48 прилегающие Соединенные Штаты и применяется только к одному адресу доставки для каждого заказа.
Заказы на доставку на Аляску, Гавайи или в другие страны не входят в это предложение.

Бесплатная доставка грузовых / грузовых отправлений осуществляется в коммерческие точки, доставка в жилые районы может повлечь дополнительные расходы. Обслуживание лифта ворот и внутренняя доставка не включены. Дополнительный сборы будут добавлены к счету по мере необходимости.


ВОЕННЫЕ ПОСТАВКИ

** Не все товары, которые мы несем, могут быть отправлены по адресам APO / FPO, пожалуйста, свяжитесь с нами перед размещением заказа.**

Военные поставки на адрес APO / FPO могут быть отправлены только через Почтовую службу США. Их максимальный вес составляет 70 фунтов. За эту услугу взимается дополнительная плата, а также стоимость доставки почтового отделения США от местного почтового отделения до APO / FPO, и счет будет выставлен клиенту. Этих дополнительных расходов можно избежать, предоставив нам пункт доставки в США для отправки.


ЗАПЧАСТИ И ПРИНАДЛЕЖНОСТИ

Бесплатная доставка не распространяется на заказы расходных материалов, запчастей и аксессуаров.К заказам, размещенным в Интернете, автоматически применяется соответствующая стоимость доставки. Пожалуйста, попросите нас помочь с расценками на доставку этих продуктов.


МЕЖДУНАРОДНЫЕ ЗАКАЗЫ И ДОСТАВКА

Международные заказы рассматриваются индивидуально. Все заказы за пределами США необходимо оплачивать банковским переводом (или в некоторых случаях кредитной картой).Любые товары, для которых предлагается бесплатная доставка, предназначены для доставки в пределах 48 смежных штатов США. Вы можете организовать доставку через экспедитора в 48 смежных штатах, и мы отправим ваш заказ в это место. Взимается плата за доставку за пределы 48 смежных штатов.

Мы отправляем за границу через крупных перевозчиков. Рекомендуем связаться с нашим клиентом сервис напрямую, чтобы получить инструкции и расценки на международные заказы.Наши расценки на международную доставку являются приблизительными. и может отличаться в момент размещения заказа. Дополнительные расходы, такие как Таможенные пошлины, брокерские сборы, сборы за хранение, налог на импорт и т. Д. Могут применяются и не входят в компетенцию Stapler Warehouse.

ПОДДОН

Наш опыт показал, что некоторые предметы имеют тенденцию быть поврежденными при транспортировке.Чтобы обеспечить безопасную доставку, мы требуем, чтобы эти товары отправлялись на поддоне. Дополнительная плата за доставку (плата за поддон) указана в Интернете под товаром, если это применимо. Некоторые клиенты не хотят платить эту плату. Для их размещения отправьте подписанный запрос, освобождающий StaplerWarehouse от любой ответственности в отношении доставки. Они также должны полностью предоплатить свой заказ банковским переводом. Тогда и только тогда мы отправим их товар любым способом, который они запросят.


ТАРИФЫ / ДОСТАВКА

К каждому заказу будет добавлена ​​соответствующая стоимость доставки.Стоимость доставки может включать дополнительную плату. Все заказы более 150 фунтов. будут предложены и отправлены наименее дорогим из доступных обычных транспортных средств (грузовиков), если не указано иное.


ГРУЗОВИК / ОБЫЧНЫЙ АВТОМОБИЛЬ

Многие товары не могут быть отправлены UPS, FedEx и т. Д. Мы попытались идентифицировать эти продукты и разместили уведомления на веб-странице конкретного продукта.Поэтому, если не указано иное, мы отправим товар наилучшим способом (т. Е. Наименее дорогим обычным перевозчиком по стоимости), который мы можем найти.

Плата за внутреннюю доставку
— это дополнительные расходы на доставку машины из грузовика для доставки к месту внутри помещения, где вы размещаете машину, и в некоторых случаях включает снятие транспортировочного поддона.

Lift Gate Delivery
относится к грузовику для доставки, оборудованному лифтом, прикрепленным к кузову грузовика, который используется для перемещения предмета из грузового пространства грузовика вниз на уровень улицы, когда нет доступной погрузочной площадки.Предмет останется на локации рядом с воротами подъемника грузовика.

Если вам требуется доставка изнутри или доставка с лифтом, пожалуйста, свяжитесь с торговым представителем, который предоставит вам расценки.

Доставка грузовиком осуществляется только в торговые точки. За доставку в жилые районы может взиматься дополнительная плата. Эти сборы будут добавлены к счетам клиентов по мере необходимости.


УВЕДОМЛЕНИЕ ОБ ОТГРУЗКЕ

НЕ подписывайте квитанцию ​​о доставке, пока вы не проверите посылку на предмет каких-либо физических повреждений.Пакеты покидают наш склад в хорошем состоянии. Если вы подпишетесь на упаковке, не заметив должным образом повреждений, мы не несем ответственности за товар. Не ограничивайте свою способность собирать иски о возмещении ущерба. Пожалуйста, откажитесь от перевозки или сделайте исключения, например: «Подлежит проверке». Это ДОЛЖНО быть отмечено в водительских документах.

2 упаковки картриджа с тонером TN570 для принтера Brother HL-5140 DCP-8040 MFC-8220 Принтер Чернила, тонер и бумага Картриджи с тонером для дома и сада

Комплект из 2 картриджей с тонером TN570 для принтера Brother HL-5140 DCP-8040 MFC-8220 Картриджи с чернилами, тонером и бумагой для дома и сада Тонер-картриджи для дома и сада

DCP-8040 Принтер MFC-8220 2 комплекта картриджа с тонером TN570 для принтеров Brother HL-5140 Подходит, 10 x TN570, Совместимость, не произведенная Brother, бесплатная доставка по всему миру, Поиск новых покупок в Интернете, Повышение продажной цены, Покупки, ориентированные на людей., MFC-8220 Принтер 2 упаковки Тонер-картридж TN570 подходит для Brother HL-5140 DCP-8040, 2 упаковки TN570 Тонер-картридж подходит для Brother HL-5140 DCP-8040 MFC-8220.






, например, коробка без надписи или пластиковый пакет. См. Список продавца для получения полной информации. См. Все определения условий : Бренд: Без марочного обозначения , MPN: : TN570 : UPC: : Не применяется ,。, не используется, если товар не изготовлен вручную или не был упакован производителем в не розничной упаковке, 2 упаковки картриджа с тонером TN570 подходят для Brother Принтер HL-5140 DCP-8040 MFC-8220.10 x TN570. Совместимость, не произведенная Brother. Содержание продукта Принтеры подходят .. Состояние: Новый: Совершенно новый. неоткрытый неповрежденный товар в оригинальной упаковке (если применима упаковка). Упаковка должна быть такой же, как в розничном магазине.

Комплект из 2 картриджей TN570 для принтера Brother HL-5140 DCP-8040 MFC-8220



100 Small Qualex Quickie Balloon clips, стяжки для герметизации, КОНТЕЙНЕРЫ ДЛЯ ОВОЩЕЙ ЛУК LEMON PEPPER KEEPER FOOD KITCHEN SAVERS ПОЛЕЗНЫЕ T P8Y8, 3M, одномодовый однопроводной оптоволоконный перемычка, волоконно-оптический кабель LC FC, косичка, Kelvin Cloth Diaper Smart Newborn Organic Умные днища. Комплект из 2 картриджей с тонером TN570 для принтера Brother HL-5140 DCP-8040 MFC-8220 . Крючки для занавески для душа Кольца скольжения Декоративные стразы из акрилового хрусталя. 15,6-дюймовый чехол-сумка для ноутбука со скрытой ручкой и плечевым ремнем 773, собственность защищена 2-й поправкой безопасности Ретро старинный забавный металлический знак 9×12, персонализированные приглашения на 11-й день рождения для мальчика и девочки Набор из 4 открыток A6, 2 упаковки TN570 тонер-картридж подходит Brother HL-5140 DCP-8040 MFC-8220 Принтер , Домашний декор Кристалл, кисточка, бисер, фиксирующие пряжки, Подвязки для оконных штор, НОВАЯ МАСЛЯНАЯ КРЫШКА HUSQVARNA 242266268272 42 66 501626602.5X Круглый пузырьковый спиртовой градусник, линейка для измерения уровня поверхности. 2 шт. 2,5 дюйма, 66 мм, 4 Ом, 4 Ом, 5 Вт, Круглый громкоговоритель для ремонта аудио, , 2 шт., Картридж с тонером TN570, подходит для принтера Brother HL-5140 DCP-8040, MFC-8220, .


2 упаковки картриджа с тонером TN570 для принтера Brother HL-5140 DCP-8040 MFC-8220

Комплект из 2 картриджей с тонером TN570 для принтера Brother HL-5140 DCP-8040 MFC-8220

Картридж с тонером подходит для Brother HL-5140 DCP-8040 Принтер MFC-8220 2 упаковки TN570, 2 упаковки TN570 Картридж с тонером подходит для Brother HL-5140 DCP-8040 Принтер MFC-8220, 2 упаковки TN570 Картридж с тонером подходит для Brother HL-5140 DCP-8040 Принтер MFC-8220.

A Обратимо запечатанная, легкодоступная, модульная (SEAM) микрофлюидная архитектура для создания тканевых интерфейсов in vitro

Abstract

Модели микрожидкостных барьерных тканей появились в качестве передовых инструментов in vitro для изучения взаимодействия с внешними стимулами, такими как кандидаты в лекарства, патогены , или токсины. Однако процедуры, необходимые для создания и обслуживания этих систем, могут быть сложными для реализации для конечных пользователей, особенно для тех, у кого нет значительных внутренних инженерных знаний.Здесь мы представляем модульный подход, который обеспечивает простой в использовании рабочий процесс для создания, поддержки и анализа микромасштабных тканевых конструкций. Наш подход начинается со съемной культуральной вставки, которая магнитно соединяется, развязана и перемещается между автономными сборными микрожидкостными модулями для упрощения посева клеток, культивирования и последующего анализа. Модульный подход позволяет использовать несколько вариантов перфузии, включая стандартные шприцевые насосы или интеграцию с автономным модулем гравитационного питания для простого обслуживания клеток.В качестве доказательства концепции мы создаем культуру первичных эндотелиальных клеток микрососудов человека (HMVEC) и сообщаем о комбинированной визуализации поверхностных белков и экспрессии генов после контролируемой апикальной стимуляции липополисахаридом бактериального эндотоксина (LPS). Мы также демонстрируем возможность включения интерфейсов гидратированного биоматериала в микрофлюидную архитектуру путем интеграции ультратонкой (<1 мкм мкм) самособирающейся культуральной мембраны гиалуроновой кислоты / пептидного амфифила с модулем Юнга для мозга (~ 1 кПа).Чтобы подчеркнуть важность включения биомиметических интерфейсов в модели на микроуровне, мы сообщаем многоуровневые данные о первичных корковых клетках крыс, культивируемых на самособирающейся мембране, и сравниваем панель мишеней мРНК с первичными сигнатурами ткани мозга. Мы ожидаем, что модульный подход и упрощенные рабочие процессы, представленные здесь, позволят широкому кругу исследовательских групп использовать модели микрофлюидных барьерных тканей в своей работе.

Введение

Микрожидкостные барьерные ткани (MBT) — это усовершенствованные модели культур in vitro , которые сочетают в себе методы микротехники с живыми клетками, чтобы помочь удовлетворить потребность в биологически репрезентативных анализах для изучения сложных биологических взаимодействий [1,2].Типичные МБТ представляют собой монолитные полимерные структуры, состоящие из синтетических микропористых культуральных мембран, необратимо герметизированных между сетками эластомерных микрофлюидных каналов; индивидуально адресуемые каналы над и под суспендированной культуральной мембраной обеспечивают превосходный контроль над биофизическими / биохимическими микроокружениями и способствуют развитию поляризованных совместно культивируемых популяций клеток в пределах архитектуры. Недавно микрофлюидные подходы были использованы для создания барьерных моделей сосудистой сети, легких, гематоэнцефалического барьера, кишечника, почек и печени [3].Эти системы расширяют возможности традиционных моделей барьеров, таких как анализ Transwell, и открывают новые возможности для исследований, позволяя получать количественные данные на уровне клеток и тканей, включая жизнеспособность; метаболическая активность; токсичность; барьерная проницаемость; клеточная миграция; и экспрессия поверхностного белка в определенных средах культивирования. [4–7]. Несмотря на то, что MBT предоставили важную биологическую информацию, их может быть трудно реализовать в лабораториях без собственных инженерных знаний.В частности, могут быть затруднены процессы, связанные с эффективным посевом клеток, поддержанием культуры и доступом к клеткам для последующего анализа. Цель представленной здесь работы — представить новый подход, который включает специализированные готовые микрожидкостные модули, чтобы помочь упростить и упростить экспериментальные рабочие процессы.

MBT требуют эффективного связывания между эластомерными каналами и подвешенными культуральными мембранами для достижения определенной апикальной и базолатеральной среды культивирования.В обычных методах склеивания используются адгезивные клеи или обработка кислородной плазмой для подготовки поверхностей к постоянному креплению. Хотя мембраны биологических культур очень эффективны в прикреплении полимеров к полимерам, их трудно включить из-за проблем, связанных с формированием герметичных уплотнений между полимерными микрожидкостными каналами и гидратированными материалами [8,9]. Постоянно запечатанные конструкции также представляют потенциальные проблемы для эффективного введения клеток на поверхность культуральной мембраны и могут потребовать значительных манипуляций и манипуляций с жидкостями для сбора клеток и лизата из системы для последующего анализа.Несколько групп представили альтернативные методы прикрепления микроканалов, включая внешние вакуумные / магнитные коллекторы или схемы механического присоединения, для сжатия жидкостных каналов против растущих слоев клеток или плоских субстратов для создания уплотнений в гидратированной среде [10]. Однако эти подходы с большим форм-фактором могут быть дорогими в производстве для одноразового использования и могут потребовать использования сложного периферийного оборудования.

С картированием генома человека и достижениями в биоинформатике геномика стала мощным подходом к исследованию действий, которые происходят перед экспрессией белка [11].Например, считывание генов может определить, может ли лекарство-кандидат специфично взаимодействовать с целевыми сигнальными путями, или направить разработку медицинских контрмер, механически исследуя взаимодействия хозяин-патоген [12]. Несмотря на то, что протоколы выделения нуклеиновых кислот хорошо известны в рамках традиционных микрожидкостных платформ «лаборатория на чипе» [13,14], надежное выделение РНК, необходимое для анализа, трудно достичь с помощью существующих платформ MBT. Проблема, вероятно, связана с неизбежными потерями пробы, которые происходят на пути прохождения жидкости во время сбора лизата из-за мертвых объемов и транспортировки по каналам с высоким отношением площади поверхности к объему [15].Альтернативные методы выделения РНК с уменьшенным количеством этапов обработки образцов могут значительно упростить сбор нуклеиновых кислот и помочь обеспечить легкий доступ к показаниям уровня генов из мембранных микрофлюидных систем.

Микрожидкостное сообщество прилагает значительные усилия для создания простых в использовании систем, которые улучшат их внедрение исследователями биологических наук за счет ограничения потребности во внешних насосах и других инструментах [16], [17]. Здесь мы сосредоточены на разработке удобного рабочего процесса, чтобы упростить эксперимент и ввести новые возможности.Наша масштабируемая, легкодоступная модульная (SEAM) платформа состоит из предварительно изготовленных микрожидкостных модулей, которые обеспечивают: i) точный посев клеток; ii) облегчить интеграцию гидратированных культуральных мембран биоматериала; iii) поддерживать надежное выделение нуклеиновых кислот; и iv) способствовать многоуровневому экспериментальному считыванию данных. В качестве доказательства концепции мы используем SEAM для проверки маркеров поверхностных белков, связанных с воспалением, и показаний экспрессии генов из первичных эндотелиальных клеток микрососудов человека (HMVEC) после апикальной стимуляции липополисахаридом бактериального эндотоксина (LPS).Мы также демонстрируем совместимость SEAM с гидратированными материалами интерфейса культур путем включения самосборной подвешенной мембраны со специфическим для мозга модулем Юнга с использованием магнитной фиксации.

Материалы и методы

Для достижения «дружественного к пользователю» подхода к установлению и анализу границ раздела тканей мы разработали архитектуру SEAM, состоящую из специализированных модулей, с использованием метода лабораторного прототипирования, сочетающего мягкую литографию, лазерную обработку и ламинирование. Как показано на, модуль культивирования был построен из i) лазерно вырезанных слоев корпуса из ПММА (толщина ПММА 1.5875 мм (1/16 дюйма), McMaster Carr, VersaLaser 40W CO 2 лазер, Universal Laser Systems) со встроенными магнитами из редкоземельных элементов (K&J Magnetics), ii) формованными микроканалами PDMS и iii) съемной вставкой для культивирования клеток.

a) Схематическое изображение архитектуры SEAM, состоящей из корпусов из ПММА со встроенными магнитами, каналов PDMS и съемной вставки для культивирования клеток. б) Изображения съемных культуральных вкладышей, включая пористые протравленные дорожки (вверху) и мягкие самособирающиеся (внизу) области культуры.Масштабная линейка = 1 мм. c) Собранный культуральный модуль SEAM с верхним и нижним микрожидкостными каналами, заполненными красными и синими красителями, чтобы продемонстрировать отдельные жидкостные компартменты в магнитозащищенной архитектуре.

ПММА Корпуса и магнитные защелки

Слои жесткого пластикового корпуса были сконструированы путем ламинирования двух вырезанных лазером кусков ПММА (базовый слой: 18 мм x 22 мм и полость: 18 мм x 22 мм с вырезом 7 мм x 11 мм) с использованием самоклеящиеся клейкие листы (Fralock). Каждый слой корпуса содержал редкоземельные магниты (2.Диаметром 54 мм), ориентированные таким образом, что верхний и нижний корпуса имели противоположные магнитные полюса, обращенные друг к другу. Полости были спроектированы для приема каналов, содержащих PDMS, как описано ниже.

Изготовление канала PDMS

Микроканалы из полидиметисилоксана (PDMS, Sylgard 184) (h = 0,25 мм, w = 1 мм, l = 9 мм) были изготовлены с использованием стандартных методов формования реплик с мягкой литографией [18]. Вкратце, УФ-реактивный фоторезист SU-8 100 (MicroChem) был нанесен методом центрифугирования на силиконовую пластину, подвергнут мягкому запеканию и затем подвергнут УФ-свету через прозрачную маску высокой плотности (Fineline Imaging, Inc.) для определения характеристик канала. Затем пластину погружали в раствор проявителя (MicroChem), чтобы удалить несшитый SU-8, и подвергали твердому спеканию, чтобы установить «мастер», используемый для создания микрофлюидных каналов. Для получения блоков PDMS определенной общей высоты мастер помещался в полость формы, состоящую из кольца из ПММА (внешний диаметр = 250 мм, внутренний диаметр = 200 мм), прикрепленного к диску из ПММА (диаметр = 300 мм) с помощью самоклеящегося клея. (Фралок). Затем полость формы была заполнена дегазированным форполимером ПДМС (соотношение основания и катализатора 10: 1).Лист прозрачного майлара был помещен поверх заполненной формы для создания плоской верхней поверхности и покрыт дополнительным кольцом из ПММА (диаметр = 300 мм). Собранную форму зажимали и помещали в печь на 6 часов при 65 ° C. Полученный блок PDMS (с общей высотой 1,7 мм) был извлечен из формы и разрезан до размера (7 мм × 11 мм) с помощью лезвия бритвы. Порты доступа заполняли сердцевиной с использованием пробойника для биопсии 1 мм (Miltex). Блоки PDMS вставлялись в верхний и нижний корпуса из ПММА, при этом канальные элементы были ориентированы внутрь устройства.

Вкладыши для клеточных культур

Как показано на, магнитная фиксация позволяет помещать культуральные мембраны между жидкостными каналами и герметизировать их на месте для поддержки разделенных (апикальных / базолатеральных) культур. Мы продемонстрировали использование двух материалов для культивирования клеток: i) стандартной микропористой культуральной мембраны с протравленной дорожкой и ii) гидратированной самособирающейся культуральной мембраны, чтобы подчеркнуть гибкость подхода с магнитной герметизацией (см.). Гидратированная подвешенная мембрана представляет собой материал, который трудно включить в модели MBT из-за вышеупомянутой несовместимости склеивания.Культуральная мембрана из полиэстера (диаметр пор 0,4 мкм, м, Sterlitech) была вырезана лазером, зажата и ламинирована между двумя листами полиэтилена (PE), вырезанными лазером, содержащими открытую центральную область и чувствительный к давлению силиконовый клей на одной стороне (Fralock ). Непористый полиэтилен изолировал жидкие компартменты и гарантировал, что сообщение между каналами происходит только через нанопористую культуральную мембрану. Листы PE также позволяли легко переносить культуральную вставку между специализированными модулями.

Для культуральной вставки, которая включала гидратированный материал, листы полиэтилена и пористые мембраны (0,1 мкм м, Steriletch) были вырезаны лазером для создания открытых центральных областей. Нанопористая мембрана с трековым травлением была расположена так, что небольшой край выходил в открытую область. Мы адаптировали жидко-жидкую супрамолекулярную химию самосборки, впервые предложенную Ступпом [19–21], для создания водопроницаемой культуральной мембраны, которая прикреплена к вставке носителя. Резервуар PDMS был заполнен 2% -ным (масс. / Об.) Раствором гиалуроновой кислоты (HA) в ацетатном буфере (pH 5.7, 50 мМ), а сверху помещали культуральную вставку. Второй резервуар для PDMS помещали поверх вставки и заполняли 3% -ным (масс. / Об.) Раствором пептидного амфифила (PA) в ацетатном буфере (pH 5,7, 50 мМ). Структура PA содержала хвост пальмитиновой кислоты, последовательность формирования бета-листа и заряженную головную группу (C 16 V 3 A 3 K 3 ). HA представляет собой отрицательно заряженный линейный полимер с большой молекулярной массой, который присутствует в большом количестве во внеклеточном матриксе млекопитающих. Структуры показаны на S1 Рис.Когда растворы вступили в контакт друг с другом, на границе жидкость-жидкость мгновенно образовалась твердая мембрана в результате процесса самосборки, вызванного гидрофобным коллапсом хвостов пальмитиновой кислоты и экранированием заряда между положительно заряженными головками PA и отрицательно заряженными HA. Толщина мембраны может регулироваться в зависимости от времени контакта жидкость-жидкость [22,23].

После самосборки мембраны осторожно промывали PBS (10 мМ фосфат натрия, 150 мМ хлорид натрия, pH 7.4). Затем мембраны устанавливали на очищенное покровное стекло в ячейке для жидкости, заполненной PBS. Модуль Юнга для мембраны был извлечен из графика отклонения кантилевера в зависимости от смещения путем подгонки данных к уравнению сферического контакта Герца с использованием предварительно откалиброванного кантилевера АСМ, модифицированного сферическим зондом 0,005 мм, как описано Soofi [24]. Толщина мембраны определялась методом АСМ в контактном режиме с использованием зонда из нитрида кремния с размером острия 27 ± нм и высотой 800 нм (Новоскан).Данные были экспортированы в NanoScope Analysis (Bruker) для анализа в Origin Pro (Origin Labs). Отсечение молекулярной массы мембраны определяли путем измерения транспорта флуоресцентно меченых декстранов, приобретенных у Sigma (10 кДа, 40 кДа, 70 кДа, 120 кДа, 150 кДа) через мембрану за 24 часа. Характеристические данные показаны на S2 Рис.

Сборка

Силы притяжения между магнитами в каждом слое корпуса герметизировали каналы PDMS относительно культуральной вставки и создавали непроницаемое для жидкости уплотнение, способное выдерживать приложенное давление ~ 35 кПа.Собранная культуральная платформа SEAM с использованием вставки культуральной мембраны с протравленным треком показана с красным красителем (верхний канал) и синим красителем (нижний канал), используемыми для идентификации отдельных компартментов. Каждый канал можно отдельно перфузировать клеточной средой для поддержания культуры или введения экспериментального тестируемого соединения (например, лекарства, вируса или токсина окружающей среды). Магнитный фиксирующий механизм позволял вводить и извлекать несущую вставку (и прикрепленные ячейки) из модулей SEAM и обрабатывать их независимо от гидравлической сети.Как показано на видео S1, процесс магнитной фиксации и герметизации культуральной вставки может легко выполнить трехлетний доброволец.

Модуль прямого посева

Как показано на, магнитная фиксация позволила обратимо запечатать несущую вставку в двухкомпонентном посевном модуле PMMA, где клетки были непосредственно введены в область культуры (площадь поверхности = 0,05 см 2 ).

a) Схема и собранный модуль посева, состоящий из верхнего и нижнего слоев корпуса и магнитоуплотненной культуральной вставки.В собранном модуле (справа) нижний канал был заполнен желтым красителем, а область добавления ячеек открытого доступа заполнена синим красителем для облегчения визуализации. б) Рабочий процесс (шаги 1–4) для создания границ раздела совместно культивируемых тканей. Желаемое количество клеток добавляли в культуральную область вставки и давали возможность прикрепиться. Затем вставка была отсоединена от корпусов из ПММА, перевернута, повторно запечатана и засеяна второй совокупностью. c) Репрезентативное изображение совместно культивированного первичного альвеолярного эпителия человека, окрашенного на окклюдин (зеленый), и первичного эндотелия микрососудов человека, окрашенного на VE-кадгерин (красный), оба с ядерным контрастом (синий).Масштабные линейки = 40 мкм.

В процессе изготовления использовались процессы лазерной резки и ламинирования, описанные для культурального модуля. Модуль прямого посева состоял из верхнего корпуса из ПММА со встроенными магнитами, отверстий для доступа и центрального резервуара. Лист PDMS, вырезанный лазером (0,125 мм, Interstate Specialty Products), был прикреплен к дну с помощью чувствительного к давлению клея (0,050 мм, Fralock), чтобы способствовать формированию герметичного уплотнения вокруг культуральной вставки во время магнитного сжатия. Нижний корпус из ПММА содержал магниты, канал для жидкости и вырезанный лазером лист из ПДМС, определяющий порты доступа для жидкости.Культуральную мембрану выровняли на нижнем слое над центральным портом доступа, и корпуса были соединены магнитом. Нижний канал и верхний резервуар были заполнены культуральной средой для поддержки прикрепления клеток, и желаемое количество клеток было добавлено непосредственно в культуральную область вставки-носителя. Посевной модуль инкубировали в течение 4–6 часов до прилипания клеток к культуральной мембране. Для совместного культивирования корпуса из ПММА с магнитной защелкой были разделены, а мембрана была перевернута и повторно запечатана между корпусами.Нижний канал был заполнен соответствующей культуральной средой для поддержки прикрепленной популяции клеток, а затем открытая сторона мембраны была засеяна второй популяцией клеток. После клеточной адгезии вставку (с прикрепленными клетками) можно было перенести в культуральный модуль.

Модуль микроперфузии

Хотя появляются альтернативные методы [25], обычные микрофлюидные подходы основаны на шприцевых насосах для контроля перфузии среды для поддержания здоровья культуры, обеспечения биомеханической стимуляции и доставки экспериментальных тестируемых соединений.Внешние насосы привлекательны благодаря динамическому контролю, который они обеспечивают, но стоимость оборудования может быть непомерно высокой, а внедрение в инкубируемой среде может быть проблематичным. Чтобы предоставить удобный вариант перфузии жидкости для поддержки простого роста клеток, мы использовали гравитационный перфузионный модуль, состоящий из горизонтально ориентированных резервуаров, заполненных жидкостью, разделенных определенной высотой. В типичных гравитационных подходах с вертикально ориентированными резервуарами разница в высоте жидкости между свободными поверхностями жидкости создает перепад гидростатического давления, Δ P = ρ г Δ z, который уменьшается как разница, Δ z , между уровнями жидкости приближается к нулю.Было показано [26], что горизонтальные резервуары поддерживают падение гидравлического давления в подключенной сети микрофлюидных каналов, поскольку Δz остается постоянным, как описано ниже.

Модуль микроперфузии был изготовлен с использованием комбинации лазерной обработки PMMA, чувствительного к давлению клея и ламинирования, описанных ранее; Подход послойного изготовления обеспечил гибкость при проектировании прототипов. Как показано на, слои включали горизонтально ориентированные входные и выходные резервуары для жидкости ( слоев 2 и 5 соответственно с толщиной ПММА = 2.5 мм), слой гидроизоляции, разделяющий резервуары ( слой 3 , h = 1 мм), сеть микрожидкостного сопротивления ( слой 4 , размеры канала: h = 0,02 мм, w = 0,5 мм, L = 25 мм), порты для доступа к входным резервуарам ( слой 1 ) и жидкостное соединение ( слой 6 ) между перфузионным модулем и магнитно связанным культуральным модулем.

a) Слои, содержащие перфузионный модуль с гравитационной подачей. б) Вид сбоку подключенных перфузионных и культуральных модулей.Контур жидкости (входной резервуар, aa, через культуральный модуль к выходному резервуару, bb) был осторожно заполнен средой с помощью шприца. c) После заполнения поверхностное натяжение удерживало среду от вытекания из резервуаров, а разница гидростатического давления Δ P вызвала поток жидкости от входного к выходному резервуару.

Как показано на, подключенные перфузионные и культуральные модули были магнитно соединены и осторожно заполнены средой до тех пор, пока каналы не будут заполнены и в каждом резервуаре не будет установлен мениск воздух-жидкость.Поверхностное натяжение между средой и поверхностями резервуара было достаточным, чтобы жидкость не разлилась в горизонтальной конфигурации, а разница гидростатического давления ( Δ P aa-bb = ρ г Δ z) между входной и выходной резервуары индуцировали поток от aa до bb. Мениск двигался горизонтально, когда жидкость текла по контуру; поскольку не было изменений относительной высоты жидкости в резервуарах ( Δ z), а гравитационное ускорение и плотность жидкости были постоянными, Δ P также были постоянными.Предполагалось, что вклады в поток, связанные с капиллярным давлением, сбалансированы, поскольку входной и выходной резервуары были построены из одних и тех же материалов и имели одинаковые внутренние размеры.

С постоянным перепадом давления ( Δ P aa-bb ) и гидравлическим сопротивлением R в каналах с низким соотношением сторон, определенными как [27]:

R = 12 мклwh4 [1−192hπ5wtanh (πw2h)] — 1

(1)

Средняя скорость потока в сети, Q avg , была рассчитана по выражению Q avg = Δ PR -1 с μ = 0.0007 [Па · сек] при 37 ° C, а w, h, L относятся к ширине, высоте и длине каждого сегмента на пути текучей среды соответственно. показывает взаимосвязь между Δ z и вычисленной средней скоростью потока в культуральном канале. Расчетная скорость потока в нашей системе (при Δ z = 3,62 мм) составила 2,42 мк л час -1 , что соответствует 58 мкл л, используемым в день (одна полная замена среды в канале культивирования. в час). Новые перфузионные модули использовались в конце каждого периода культивирования.

Таблица 1

Дифференциальная высота в зависимости от прогнозируемого расхода и напряжения сдвига.

μ 900g ]
Дифференциальная высота, Δz [мм]
1 3,6 5 10 20
1,36 2,42 3,34 6,68 13,6
τ [дин см -2 ] 0.00013 0,0045 0,0006 0,0013 0,0026

Соответствующее напряжение сдвига в культуральном канале было рассчитано как 0,00045 дин см -2 с использованием выражения [28] в уравнении 2, с γ ( соотношение сторон культурального канала) = 0,25 [-].

τ = 6μQwh3 {2,95γ <0,251,158+ (1- (γ)) - 20,25≤ γ≤0,85}

(2)

Среды с контролируемым сдвигом могут быть полезны при поддержании культур с использованием чувствительных к сдвигу клеток, таких как как нейроны и популяции стволовых клеток [29].Результаты расчетов напряжения сдвига приведены в таблице. Для исследований, где требуются более высокие значения напряжения сдвига, увеличение напора давления (например, 15,875 мм или 5/8 дюйма), удаление сети сопротивления и уменьшение ширины культурального канала до 0,40 мм и высоты до 0,1 мм позволяет получить теоретические напряжения сдвига на порядка 10 дин см -2 .

В варианте осуществления, показанном здесь, цель перфузионного модуля заключалась в демонстрации необязательного автономного варианта, способного поддерживать первичные клетки человека в культуре без необходимости использования насосных методов, управляемых приборами.Тем не менее, модульная природа платформы SEAM позволяет при желании реализовать традиционные методы откачки, включая шприцевые насосы (S5 рис., На котором показано подключение к внешнему насосу и взаимосвязь между несколькими модулями культивирования).

Посев клеток

Культуральная вставка была запечатана в посевном модуле, а нижний канал был заполнен соответствующей культуральной средой. Затем в верхний резервуар загружали фибронектин (5 мкл мкг / мл -1 ) и инкубировали (37 ° C при 5% CO 2 ) в течение ночи для покрытия мембраны.Резервуар и канал опорожняли пипеткой, промывали PBS (10 мМ фосфат натрия, 150 мМ хлорид натрия, pH 7,4) и заполняли соответствующей культуральной средой (ScienCell). Первичные HMVEC (ScienCell) размораживали в соответствии с инструкциями производителя и высевали на покрытые фибронектином планшеты для культивирования тканей. После одной субкультуры клетки обрабатывали трипсином и ресуспендировали при концентрации 500000 клеток на мл -1 . 2 мкл л суспензии добавляли в каждую открытую лунку (вход ~ 1000 клеток) посевной платформы непосредственно над областью культивирования сэндвичной культуральной вставки.Клетки визуализировали с помощью инвертированного микроскопа (Olympus IX-70) для обеспечения равномерного покрытия. Затем посевной модуль инкубировали до прилипания клеток к мембране (4-6 часов). Кортикальные нейроны крыс (ScienCell) обрабатывали в соответствии с инструкциями производителя. Из-за хрупкой природы нейронов клетки высевали непосредственно в планшет для культивирования ткани из полистирола, покрытый ГК (Nunc), или на самособирающуюся мембрану при плотности 30 000 клеток на см -2 .

Для совместного культивирования клетки HMVEC засевали, как описано выше.Затем мембрану отсоединили и перевернули. Нижний канал был заполнен средой HMVEC, а посевной резервуар был заполнен культуральной средой легочных альвеолярных эпителиальных клеток (HPAEpiC) (ScienCell). Затем в резервуар добавляли HPAEpiC в концентрации 20 000 клеток на см -2 . Среду меняли дважды в день. После трех дней культивирования клетки на мембране фиксировали и повышали проницаемость для иммуноцитохимии.

Иммуноцитохимия

Клетки фиксировали 4% параформальдегидом (Sigma) в PBS в течение 20 минут с последующей пермеабилизацией 0.1% Triton X-100 в PBS в течение 15 минут. Затем клетки блокировали 2% BSA в PBS в течение 2 часов. Первичные антитела против MAP2 (1: 000, Sigma) или ICAM-1 (1:40, R&D Systems), окклюдина (1: 1000, конъюгированный с Alexa 488, Invitrogen) или кадгерина эндотелия сосудов (VE-Cad, 1:10, R&D Systems) и инкубировали в течение 6–8 часов при 4 ° C. Раствор первичных антител удаляли, клетки осторожно промывали PBS, а затем инкубировали в течение двух часов со вторичными антителами, конъюгированными с Alexa 647 (1: 500, Life Technologies) или Qdot 625 (1: 500, Life technologies).Ядра окрашивали DAPI (Life Technologies) при 15 мкм мкг / мл -1 . 12-битные изображения были получены с помощью программного обеспечения ImagePro на микроскопе Olympus IX-70 с камерой Photometrics CoolSnap HQ2. Настройки экспозиции были выбраны так, чтобы свести к минимуму фоновую флуоресценцию. Обработка изображений производилась в ImageJ, и настройки были применены одинаково ко всем образцам. Мембраны визуализировали непосредственно в устройстве или удаляли и устанавливали на предметные стекла микроскопа, покрывали PBS и закрывали покровным стеклом перед визуализацией.

Генный анализ

Кортикальные нейроны крысы : Культуральные вставки отделяли от культурального модуля стерильными пинцетами и помещали в 150 мкл л RNAzol RT (Центр молекулярных исследований). С этого момента экстракция РНК происходила в соответствии с инструкциями производителя. Клетки лизировали с помощью пипетки и раствор центрифугировали при 12000 g в течение 2 минут. Супернатант помещали в пробирку, свободную от РНКазы, и к раствору добавляли 150 мкл л абсолютного этанола.Смесь встряхивали, затем помещали в колонку Zymo-Spin IIC и центрифугировали при 12000 g в течение одной минуты. Затем колонку промывали и обрабатывали ДНКазой для удаления любых загрязняющих ДНК. РНК элюировали 50 мкл л сверхчистой воды. Качество РНК определяли с помощью набора RNA 6000 на Bioanalyzer (Agilent Technologies). Затем для синтеза кДНК РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием набора для синтеза кДНК iScript (Bio-Rad) в соответствии со спецификациями производителя. Каждую реакцию проводили в дублирующих лунках с генами домашнего хозяйства (GAPDH [5 ‘VIC], ACTB [5’ FAM], RPL13A [5 ‘TET]), детектированными мультиплексно с использованием зондов TaqMan (эндогенные контрольные наборы Applied Biosystems, Life Technologies) в в одной лунке и интересующий ген обнаруживают в другой лунке с использованием мастер-микса SYBR Green PCR (Life Technologies) на CFX96 (Bio-Rad).Гены-мишени включали: Neurodap1, NCAM1, c-fos, trkA (прямой и обратный праймеры, показанные на S3 фиг.). Метод ΔΔ Ct был использован для расчета количества мРНК относительно генов домашнего хозяйства после экспериментальной нормализации фактора лунки. Для каждой биологической реплики проводили две реакции обратной транскрипции с одним контролем без RT. Для каждой сгенерированной кДНК были выполнены три технических повтора с двумя контролями без матрицы. Определение порогового значения Ct с достоверностью 99% определяли путем умножения стандартного отклонения NTC для каждого целевого гена на 6.965. Контрольные эксперименты с использованием РНК из мозга нормальной крысы (Takara Clontech) обрабатывали, как указано выше, для получения данных для сравнения. Данные представляют собой среднее значение со стандартным отклонением.

HMVEC : После стимуляции LPS экстракцию РНК клеток в устройстве проводили с использованием набора Quick RNA Microprep от Zymo (Cat. R1050). Культуральные вставки (и клеточный слой) отделяли от культуральных модулей и немедленно погружали в 600 мкл л ZR-буфера из набора Microprep и центрифугировали для лизирования всех клеток.С этого момента экстракция РНК происходила в соответствии со спецификациями производителя. РНК элюировали 10 мкл л воды, свободной от нуклеаз, и качество РНК определяли с помощью набора Agilent RNA 6000 Pico Kit (Agilent, 5067–1513). Для экстракции РНК из интактных устройств эквивалентный объем (600 мкл л) буфера для лизиса из набора RNA Microprep вручную пипеткой переносили в культуральный модуль и собирали. Собранный раствор затем загружали в колонки для очистки, и экстракция продолжалась в соответствии с указаниями производителя.

Для синтеза кДНК 5 нг РНК из каждого образца использовали для создания кДНК с использованием набора для синтеза кДНК Superscript VILO (Life Technologies, Cat. 11754-050) в условиях, рекомендованных производителем. Для количественной ПЦР 100 нг кДНК использовали в индивидуальных анализах экспрессии гена Taqman (Applied Biosystems). Относительная экспрессия фактора фон Виллебранда (Hs00169795_m1), ICAM-1 (Hs00164932_m1), кадгерина 5 (Hs003_m1), CXCL1 (Hs00236937_m1), CXCL2 (Hs00601975_m1) и CXCL2 (Hs00601975_m1) и CCL4 Δ1401 (Hs002000) была проанализирована с использованием метода 9Δ200034 (Hs002000). GAPDH (Hs99999905_m1) служил в качестве положительного контроля для нормализации, а уровень экспрессии без стимуляции LPS служил в качестве базального уровня.Для каждой сгенерированной кДНК были выполнены три технических повтора с двумя контролями без матрицы. Определение порогового значения Ct с достоверностью 99% определяли путем умножения стандартного отклонения NTC для каждого целевого гена на 6,965.

Результаты

Модульный подход и съемная вставка для культивирования в платформе SEAM позволили использовать рабочие процессы, сочетающие прямой доступ к клеткам, обеспечиваемый открытыми культурами, с характерными возможностями культивирования, присущими микрожидкостным системам.Как схематично описано в рабочем процессе (), культуральные вставки были обратимо соединены с модулями посева для точного микромасштабного посева, затем перенесены в модуль микрожидкостной культуры для исследований культивирования клеток и стимуляции LPS с использованием модуля микроперфузии (вариант 1). После стимуляции были получены экспериментальные данные с помощью дифференциальной иммуноцитохимии поверхностных белков или путем отделения культуральной вставки от модуля и передачи ее в коммерческий технологический процесс вне чипа для достижения высококачественного выделения нуклеиновых кислот для последующего анализа.

Варианты экспериментального рабочего процесса SEAM.

a) Клетки высевают непосредственно в культуральную область желаемой вставки с известной плотностью с использованием модуля посева. б) Культуральная вставка с прикрепленными клетками переносится на платформу для культивирования для долгосрочной перфузионной культуры и исследований воздействия. c) Затем вставку можно напрямую перенести для лизиса вне чипа и выделения нуклеиновой кислоты или d) установить на предметное стекло для визуализации. Клетки также могут быть визуализированы внутри платформы с помощью объектива с большим рабочим расстоянием.e) Модульный подход позволяет легко исследовать комбинацию изображений и ответов на уровне генов.

Проверка показаний SEAM с использованием HMVEC, стимулированного LPS.

HMVEC выстилают кровеносные сосуды и играют важную роль в обеспечении проницаемости сосудов, регуляции кровотока, заживлении ран и воспалении [30]. Липополисахарид бактериального эндотоксина (ЛПС) является компонентом клеточной стенки грамотрицательных бактерий и часто используется для изучения воспаления. Известно, что ЛПС активирует рецепторы Toll-подобного рецептора 4 (TLR4) на эндотелиальных клетках и индуцирует повышающую регуляцию молекул адгезии на клеточной поверхности, чтобы облегчить арест нейтрофилов [31] и увеличить производство хемокинов для набора и активации дендритных клеток и макрофагов [32]. ].Мы использовали эту хорошо изученную модель сосудистого воспаления для проверки многоуровневых показаний SEAM, как показано на. Первичные HMVEC высевали на микропористую культуральную область вставки (площадь поверхности = 0,05 см 2 ) с использованием модуля прямого посева. Площадь культуральной поверхности мембраны была выбрана для размещения монослоя контактно ингибированных клеток (~ 20 000 клеток на см — 2 ) с использованием входной популяции в 1000 клеток. 1000 клеток можно было легко и воспроизводимо пипетировать, что помогло снизить стоимость одного анализа.Размер несущей мембраны (7 мм x 11 мм) был разработан таким образом, чтобы она помещалась непосредственно во флакон для выделения клеток в соответствии со стандартным протоколом выделения РНК, при этом ее необходимо было разрезать или манипулировать другими способами.

Показания SEAM после стимуляции LPS.

a) Для исследования показаний SEAM, имитирующих сосудистое воспаление, эндотелиальные клетки микрососудов человека были засеяны и перенесены в связанные модули культуры и микроперфузии. б) После апикального моделирования с помощью LPS в течение 4 часов клетки окрашивали в канале и мембрану переносили на предметное стекло для исследования экспрессии на поверхности ICAM1 после воздействия стимуляции.Масштабная линейка = 40 мкм. c) Чтобы продемонстрировать быстрое и надежное выделение РНК, вставки были удалены из архитектуры и перенесены на выделение РНК вне кристалла. Статистически значимые (p <0,001) различия в экспрессии мРНК наблюдались в ICAM1, CXCL1, CXCL2 и CCL2, при этом VFW (эндотелиальный маркер) оставался постоянным. SEAM может воспроизводить как экспрессию генов, так и дифференциальные ответы поверхностных белков на стимуляцию ЛПС с помощью простого в использовании рабочего процесса.

После прикрепления клеток культуральную вставку перенесли в культуральный модуль и подключили к модулю микроперфузии на 24 часа культивирования ().Затем перфузионный модуль заменяли новым, и клетки подвергали воздействию LPS через апикальный канал в течение 4 часов, в то время как базальный канал перфузировали культуральной средой. После стимуляции устройства были рандомизированы и отобраны для иммуноцитохимии ICAM-1 или экстракции РНК для последующего анализа экспрессии генов. Разделение и перенос культуральной вставки (с прикрепленными клетками) позволили выделить РНК из всей популяции клеток с использованием оптимизированной коммерческой технологии вне чипа без необходимости обработки жидких образцов.Мы успешно достигли высокого качества выделения РНК (RIN ~ 10, S4 Fig) из небольшой начальной популяции клеток. Клетки, выделенные с использованием внутриканальных методов, также показали высокий RIN (среднее значение = 9,5), но показали вдвое меньший выход РНК (34,1 ± 1,38 нг против 17,3 ± 1,17 нг). Хотя дальнейшие этапы очистки могут противодействовать низкому выходу РНК, метод мембранного переноса значительно упростил процесс и снизил потенциальные источники ошибок за счет исключения этапов обработки образцов. Прямой перенос клеточной популяции предоставляет возможность для рентабельного экспериментального масштабирования и поддерживает методы анализа всего генома, такие как RNA-Seq или miRNA-Seq, которые исследуют глобальные транскриптомные профили без a priori целевой спецификации.

показывают клетки, окрашенные на ICAM-1, и профиль экспрессии гена, отражающий индуцированные LPS изменения мРНК. Значительное увеличение экспрессии мРНК было обнаружено для ICAM-1, CXCL1, CXCL2 и CCL2 (* p <0,001). ICAM-1, молекула поверхностной адгезии, участвующая в остановке свертывания лейкоцитов, была активирована в 2,5 раза, в то время как CXCL1 и CXCL2, хемокины, участвующие в рекрутинге нейтрофилов и лимфоцитов, увеличились в 5 и 11 раз соответственно. Было показано, что CCL2 способствует инфильтрации дендритных клеток и моноцитов, а экспрессия мРНК увеличивается в 6 раз по сравнению с нестимулированным контролем.Уровни мРНК эндотелиального фенотипического маркера фактора фон Виллебранда оставались неизменными, как и ожидалось для здорового контроля. Окрашивание ICAM-1 между стимулированными и нестимулированными клетками продемонстрировало, что изменения мРНК транслировались в изменения уровня белка в системе. Используя автономную платформу SEAM, удалось продемонстрировать изменения уровня мРНК и белка в результате контролируемой стимуляции LPS.

Культивирование нейронов и сравнение экспрессии генов на различных субстратах

Общая цель микромасштабных моделей барьеров in vitro состоит в создании физиологически репрезентативной среды культивирования (например,грамм. биохимические сигналы, механическая стимуляция, межклеточная коммуникация и межклеточные взаимодействия), в которых необходимо изучить реакции на тканевом уровне. Влияние биохимических сигналов и механической стимуляции на микрофлюидные структуры хорошо задокументировано в литературе [33]. Также хорошо установлено, что биофизические взаимодействия между клетками и их субстратом могут влиять на экспрессию генов и управлять фенотипическими изменениями посредством передачи сигналов извне-внутрь [34–37]. Несмотря на то, что был достигнут значительный прогресс в разработке биоматериалов и тканевых каркасов с четко определенными биомиметическими свойствами [38,39], методы приостановки этих границ раздела культур внутри микрофлюидных платформ появлялись медленно.Обратимо запечатанная архитектура, предоставляемая SEAM, может решить эту проблему и обеспечить легкое включение гидратированных интерфейсов культур, чтобы помочь имитировать структуру ткани-мишени.

Например, кора головного мозга или «серое вещество» играет важную роль в нескольких процессах высокого уровня, включая движение и восприятие. ECM мозга имеет уникальный состав с низким процентом фиброзных белков (например, коллагена и фибронектина) и высоким процентом протеогликанов, включая HA [40,41].Чтобы продемонстрировать возможности SEAM, включающие биомиметические мембраны и выделение нуклеиновых кислот, мы количественно оценили различия в уровне генов между клетками коры головного мозга крысы, выращенными на мягком подвешенном биомиметическом интерфейсе HA / PA со специфическим для мозга модулем Юнга (~ 1 кПа), и клетками, выращенными на жесткой пластиковой поверхности с покрытием.

Как показано на, «мягкая» мембрана HA / PA (E ~ 1 кПа) была привязана к несущей вставке с использованием процесса самосборки жидкость-жидкость. После посева и трехдневного культивирования на самособирающейся мембране (внутри культурального модуля) или стандартной пластине для тканевых культур нейроны либо окрашивали на дендритный маркер, MAP2, либо использовали в анализе экспрессии генов для NeuroDap 1, который играет важную роль. в синаптической коммуникации [42]; молекула нейрональной адгезии 1 (NCAM-1), гликопротеин, участвующий в межклеточной адгезии, росте нейритов и пластичности [43]; c-fos — непрямой маркер нейрональной активности [44]; и киназа рецептора тропомиозина A (TrkA), рецептор с высоким сродством к фактору роста нервов (NGF), который активирует факторы транскрипции для контроля передачи сигналов в соме [45,46].Эти мишени мРНК представляют широкий спектр адгезионных белков, рецепторов и показателей нейрональной активности и были выбраны, чтобы помочь оценить потенциальную важность жесткости субстрата с нескольких точек зрения. По сравнению с нейронами, посаженными на жесткие пластиковые субстраты для тканевых культур, клетки, культивированные на самособирающейся культуральной мембране, показали интересное сходство с профилями экспрессии генов из РНК, выделенной из ткани головного мозга крысы (). Включение гидратированных биоматериалов с использованием архитектуры SEAM в сочетании с надежной изоляцией РНК обеспечивает экспериментальные возможности, которые могут помочь повысить актуальность будущих моделей микрофлюидного барьера in vitro , позволяя экспериментально контролировать передачу сигналов извне-внутрь.

a) Включение самосборной мембраны в ламинированную несущую вставку. Модуль Юнга мембраны аналогичен мозгу. б) После 3 дней культивирования на мембране SA отдельные мембраны окрашивали на MAP2 (дендридный маркер, масштабная линейка = 40 мкм) и обрабатывали для анализа экспрессии генов. Экспрессия генов Neurodap1, NCAM1, TrkA и c-fos на мягком самоорганизующемся субстрате была ближе к экспрессии генов мозга крысы (пунктирная горизонтальная линия), чем экспрессия генов, выращенных на жестких субстратах.

Обсуждение

Для поддержки удобных для пользователя методов создания, поддержки и анализа микромасштабных интерфейсов тканей мы разработали автономную платформу, состоящую из съемной вставки для культивирования клеток и отдельных готовых модулей для микрофлюидных операций. Обратимо запечатанная архитектура SEAM позволяет быстро соединять, разъединять и переносить культуральную вставку между модулями для достижения эффективного экспериментального рабочего процесса. Модульный подход также обеспечивает уникальные преимущества, связанные с i) эффективным посевом клеток, ii) простым включением специализированных биологических интерфейсов, iiii) надежной изоляцией нуклеиновых кислот, iv) генерацией многоуровневых считываний и v) упрощенной и удобной работой.

Вставка для культуры клеток

Концепция съемной вставки для культуры клеток является ключевым аспектом платформы SEAM. Вставка состояла из микромасштабной пористой области культуры клеток, окруженной непористым носителем, который облегчал перенос и связывание с различными жидкостными модулями. Ламинирование вырезанных лазером полиэтиленовых листов (с клеем, чувствительным к давлению на одной стороне) совместимо с коммерчески доступными микро- и нанопористыми мембранами, которые были оптимизированы для обеспечения низкой автофлуоресценции, высокой оптической прозрачности и определенного распределения пор по размерам.Также могут быть включены такие материалы, как ультратонкие наномембраны [47, 48], коллагеновые пленки [49], листы гидрогеля [50], структурированные субстраты [51, 52], коммерческие продукты EMC [53] и слоистые композитные биоматериалы [54]. для дальнейшей настройки интерфейса культуры, чтобы отразить физиологию ткани.

В традиционных микрожидкостных технологиях для постоянного уплотнения мембран между эластомерными каналами в основном используется связывание кислородной плазмой, и возникают трудности с формированием прочных, непроницаемых для жидкости уплотнений при наличии гидратированных материалов.Благодаря концепции магнитной защелки и съемной культуральной вставки материалы для культивирования не обязательно должны быть напрямую совместимы с общим методом изготовления архитектуры. Мы продемонстрировали подход привязки, включающий тонкую самособирающуюся мембрану с модулем Юнга, адаптированным для имитации среды мозга (~ 1 кПа). Этот метод изготовления самосборки мембран жидкость-жидкость на основе интерфейса [55] был выбран потому, что трудно включить этот тип культурального субстрата в микрофлюидную платформу на основе мембран.Включение гидрофильных (полиэфир) и гидратированных мембранных материалов (HA / PA) также сделало возможным простое смачивание и заполнение без модификации поверхности и ограниченного введения и образования пузырьков внутри каналов. В том маловероятном случае, когда наблюдается пузырек, систему можно разобрать, чтобы устранить препятствие.

Наша адаптация самосборной мембраны к культуральной вставке позволяет манипулировать подвешенной мембраной толщиной 900 нанометров на протяжении всего рабочего процесса (например.грамм. посев, культивирование, визуализация и выделение нуклеиновых кислот). Тонкие культуральные мембраны могут помочь точно представить динамику межклеточной коммуникации через тканевый интерфейс. Например, паракринные сигнальные факторы, перемещающиеся через культуральную мембрану толщиной 10 мкм, требуют в 100 раз больше времени, чем для мембраны толщиной 900 нм. Некоторые барьерные ткани (включая альвеолярно-капиллярный интерфейс [56] и гематоэнцефалический барьер [57]) содержат слои поляризованных клеток, разделенных субмикрометровыми расстояниями; Возможность включения ультратонких биоматериалов, изготовленных на заказ, дает уникальную возможность воспроизводить физиологические структуры тканей.Мы наблюдали этот феномен в нашем доказательстве принципиальной демонстрации при изучении изменений на уровне генов в нейронах крыс, культивируемых на мягких и жестких интерфейсах. Функциональные последствия этих изменений на уровне генов необходимо изучить более подробно, а архитектура SEAM обеспечивает удобный подход для включения передовых биологических интерфейсов для повышения актуальности анализов in vitro .

Мы обнаружили, что разделение и перенос культуральной вставки позволили получить высококачественную изоляцию нуклеиновых кислот из образцов малых клеток.После экспериментального воздействия вставка (со всей популяцией клеток) была отделена от архитектуры с помощью обратимой магнитной фиксации и перенесена непосредственно в рабочий процесс протокола изоляции вне кристалла. Возможность перемещать всю популяцию клеток без манипуляций помогла ограничить потери образцов, которые неизбежно происходят при транспортировке клеточных лизатов в микрофлюидных каналах с высоким отношением площади поверхности к объему. Используя подход переноса, мы смогли достичь значений RIN, приближающихся к максимальному значению 10 из ~ 1000 входных ячеек.Значения RIN также были высокими при использовании внутриканального лизиса и сбора (среднее значение = 9,5), но приводили к примерно в 2 раза меньшему количеству РНК и сбора по сравнению с методом переноса культуральной вставки. Техника съемной культуральной вставки позволила просто и быстро перенести всю популяцию клеток для выделения РНК, не требуя манипуляций с жидкостью.

Хотя в этой работе мы продемонстрировали считывание дифференциальной экспрессии генов, перенос вставки позволяет использовать широкий спектр оптимизированных коммерческих методов, включая анализ для изучения повреждений ДНК, генотоксичности и транскриптомики всего генома (например,грамм. miRNA-Seq или RNA-Seq), которые исследуют паттерны активации глобального пути, возникающие в результате взаимодействия с кандидатом в лекарство или патогеном. Несмотря на то, что хорошо известно, что активация сигнального пути на уровне мРНК не обязательно приводит к экспрессии белка и функциональному ответу, считывание на уровне генов дает важную информацию для выявления потенциально взаимосвязанных путей, которые можно использовать для оценки потенциальной токсичности и определения терапевтических подходов. разработка. Анализы белков на основе КПЦР (например,грамм. TaqMan Protein Assays) можно включить в рабочий процесс для прямой корреляции экспрессии мРНК с уровнями белка и изучения посттрансляционной модификации белка. Кроме того, съемную культуральную вставку можно закрепить на предметном стекле для визуализации с высоким разрешением внутриклеточной локализации и локализации белка на поверхности. Концепция переносной вставки открывает двери для расширенных многоуровневых считываний, которые обеспечивают уникальное понимание того, как ткань взаимодействует с внешним агентом.

Прямой посев клеток

В постоянно герметичных мембранных системах интерфейсы тканей устанавливаются путем введения клеток внутрь устройства путем пропускания клеточной суспензии через микрофлюидные каналы, которые находятся в контакте с культуральной мембраной; поток останавливается, и клетки оседают на поверхности мембраны.Процесс седиментации по всей длине канала затрудняет контроль начальной плотности клеток и воспроизводимое введение того же количества клеток в систему. Следует также соблюдать особую осторожность, чтобы предотвратить попадание пузырьков во время процесса введения проточной ячейки. Посев клеток значительно упрощается на традиционных платформах для культивирования открытого формата, таких как чашки Петри и многолуночные планшеты, где клетки непосредственно добавляются на поверхность культуры с помощью наконечника пипетки. Здесь воспроизводится простота открытого посева путем обратимого связывания культуральной вставки в посевном модуле; определенное количество клеток добавляется непосредственно в область культуры через открытый резервуар.Прямой посев может значительно уменьшить количество клеток, необходимых для эксперимента, и позволить использовать редкие или дорогие популяции клеток, включая стволовые клетки, первичные клетки человека и клинически значимые образцы.

Например, типичная микрофлюидная система засеяна примерно 20 000 первичными человеческими клетками на одной стороне мембраны [58]. Для коммерческой первичной популяции клеток человека стоимостью ~ 600 долларов за миллион клеток и при условии, что 100% клеток равномерно доставляются в область культивирования без потери образца, консервативные затраты, связанные с клетками, составляют 12 долларов за анализ.С помощью метода прямого посева ~ 1000 клеток можно ввести непосредственно в определенную область культуры с минимальной потерей образца, поскольку манипуляции с жидкостью не требуются. Соответствующая стоимость, связанная с клетками, снижена до 0,60 доллара за анализ (20-кратное сокращение), что облегчает масштабирование эксперимента и повышает практическую полезность. Поскольку площадь культивирования клеток и количество вводимых клеток известны, поверхностную плотность посева можно быстро оптимизировать в соответствии с потребностями конкретной ткани. Модуль посева также позволяет легко создавать совместные культуры: i) засевая одну сторону области культуры, ii) ожидая прикрепления, и iii) отсоединяя, переворачивая и повторно закрывая вставку перед непосредственным засеиванием другой стороны.После второй фазы прикрепления клеток мембрану можно перенести непосредственно в культуральный модуль.

Микроперфузия и культивирование клеток

Обычные платформы для культивирования требуют шприцевых насосов для подачи жидкости через платформу. Стремясь сделать микрофлюидные анализы доступными для широкого круга конечных пользователей, мы разработали вариант модуля с гравитационной подачей, который обеспечивает возможности микроперфузии в нашей автономной системе. Модуль микроперфузии можно использовать для поддержания клеточных культур или воздействия экспериментальных соединений на апикальные или базолатеральные популяции.Каждый резервуар адресуется индивидуально и может использоваться для создания физиологической среды культивирования, такой как культура раздела воздух-жидкость, что актуально в моделях роговицы, кожи и легких. Наша опция перфузии без оборудования также делает платформу пригодной для использования в учреждениях BSL3 / 4, где шприцевые насосы трудно реализовать из-за рисков образования аэрозолей и проблем, связанных с проблемной дезактивацией [59]. Уравнения 1 и 2 используются для оценки дебитов, требуемых объемов коллектора и касательных напряжений.Изменение физических конструктивных параметров (высоты каналов и падения давления) можно легко изменить для достижения желаемых характеристик перфузии. Как показано на дополнительном рис. S5, модульный подход также позволяет напрямую взаимодействовать с шприцевыми насосами или другими насосными механизмами для обеспечения стимуляции сдвига, если это необходимо. В этой демонстрации микрофлюидные каналы были сформированы из PDMS и использованы для герметизации каналов против культуральной вставки при магнитном сжатии и обеспечения разделенной культуральной среды.PDMS имеет несколько благоприятных свойств, включая оптическую прозрачность и простоту изготовления, но у материала также есть хорошо известные проблемы, связанные с разделением небольших гидрофобных молекул на массу [60,61]. В таких ситуациях, как тестирование кандидатов в низкомолекулярные лекарственные препараты, полиуретан может использоваться для минимизации эффектов разделения [62].

Модульное прототипирование и системы нового поколения

Используемый здесь процесс изготовления на основе лазерной резки и ламинирования идеально подходит для повторений дизайна и разработки прототипов; при наличии опыта партию или 5–10 модулей можно разрезать, выровнять и собрать менее чем за пять минут.После завершения дизайна модули можно масштабировать для мелкосерийного производства с использованием методов горячего тиснения или переводить на литье под давлением для крупномасштабного производства. Перечень комбинированных модулей для поддержки экспериментальных исследований может быть создан как на стадии лабораторного прототипа, так и на стадии усовершенствованного прототипа. Таким образом, конечные пользователи могут легко вводить необходимые возможности.

Используемая везде техника магнитного сцепления также обеспечивает простой подход для соединения различных тканевых модулей вместе (например,грамм. от сердца к легким) через магнитный коллектор для изучения многомодульных взаимодействий лекарств или токсинов (S5, рис.). Экспериментальное масштабирование может быть достигнуто путем подключения нескольких модулей к общему источнику перфузии. Модульный подход также позволяет интегрировать микрожидкостные иммуноанализы в линию с SEAM для анализа секретируемых белков из небольших популяций клеток [63–65], а метод послойного изготовления может поддерживать интеграцию электродов для обеспечения измерений целостности барьера в реальном времени. Архитектура обратимого SEAM обеспечивает технику для изучения многоуровневых считываний клеток, культивируемых на различных субстратах с определенными биохимическими и биомеханическими свойствами.Было показано, что материал HA / PA, используемый в нашей работе, увеличивает ответ на перепад давления на границе раздела [23]; эта возможность может быть использована в будущих исследованиях для внедрения механического растяжения типа «орган на чипе» на границы раздела тканей, поддерживаемых в SEAM. Благодаря недавним достижениям в аддитивном производстве из нескольких материалов, прямая 3D-печать может выйти за рамки простых жестких материалов корпуса и разработать интегрированные жесткие и гибкие элементы, которые можно использовать для обратимого уплотнения мембран клеточных культур общего класса, а также ввести механическую стимуляцию для лучшего имитации физиологическая микросреда без ущерба для простоты использования.

Исследования по оптимизации ключевых областей герметизации дренажных скважин в сверхтолстых угольных пластах

Дренаж газа является важным средством газового контроля. Влияние ключевого положения уплотнительного отверстия на дренаж газа было изучено с помощью теоретического и численного моделирования в сочетании с полевыми измерениями для решения проблемы низкой концентрации газа в скважинах предварительного дренажа газа на угольных шахтах Китая. Путем анализа распределения трещин вокруг скважин и закона утечки воздуха, а также моделирования дренажного эффекта различных участков уплотнения (8 м, 12 м и 16 м) было предложено, чтобы ключевое положение отверстия уплотнения находилось в область предпиковой концентрации напряжений.В соответствии с фактической ситуацией на руднике Баоде была предложена схема испытаний на герметичность различных участков уплотнения, и были проведены полевые испытания для определения ключевой области герметизации скважин для предварительной дренажной газовой скважины на руднике Баоде. Исследования показывают, что при площади уплотнения 8–16 м средняя концентрация газа составляет 63,57%, а средний поток чистого газа составляет 0,408 м 3 / мин. Эффект уплотнения этой области лучше, с меньшим количеством трещин, чем у существующей области уплотнения, что эффективно предотвращает утечку газа и увеличивает концентрацию газа и скалярность газа.

1. Введение

Уголь, как основная энергия Китая, жизненно важен для экономики Китая. Однако горнодобывающий процесс сталкивается с производственной небезопасностью, особенно с газовыми авариями в угольных шахтах [1, 2]. Дренаж шахтного газа является важной мерой по сокращению выбросов шахтного газа и предотвращению самовозгорания в выработках [3–6], взрывов газа и выбросов газа [7–9]. В Китае эффективность отвода газа из угольных шахт, как правило, низкая, отрицательное давление относительно низкое, цикл осушения скважины короткий, а эффект дренажа неудовлетворительный [10].Подача газа недостаточна из-за снижения газоносности скважины [11, 12]. Во время отвода газа инфильтрация воздуха с одной стороны проезжей части вызывает низкую концентрацию отвода газа из-за плохого герметизирующего эффекта ствола скважины [13, 14].

Секция уплотнения должна быть уплотненной и плотной, чтобы избежать утечки газа [15]. Если нельзя гарантировать низкую проницаемость уплотнительной секции, будет создан канал просачивания газа и вдыхания наружного воздуха. Повреждение уплотнения также вызовет утечку герметизирующей среды.Ключом к герметизации ствола скважины является заделка трещин в породе, окружающей ствол скважины. Практика показывает, что герметизирующий эффект обеспечивается только тогда, когда герметизирующий материал скважины попадает в поры и микротрещины вокруг скважины. Таким образом, микроскопические характеристики герметизирующего участка ствола скважины и его герметизирующие характеристики по отношению к зоне трещин окружающей породы ствола скважины являются основными факторами, влияющими на герметизирующий эффект ствола скважины, и это сконцентрированный вариант герметизирующего механизма ствола скважины [16, 17 ].Поскольку ствол скважины будет сползать из-за напряжения на месте, поверхность затвора ствола скважины находится в состоянии микродвижения, что создает проблемы для затвора ствола скважины. Поскольку скважины подвержены влиянию времени, напряжение окружающей породы, вызванное добычей угля и другими возмущениями, многократно сжимается, так что трещины вокруг ствола скважины непрерывно генерируются, пересекаются и соединяются, а трудность герметизации ствола скважины заключается в своевременной герметизации эти новые трещины [18, 19]. Поскольку пористость угля является основным местом обогащения газа, а трещина в угольной породе является основным каналом миграции газа, степень развития и характеристики распределения пористости и трещин в угольном коллекторе напрямую влияют на адсорбцию, десорбцию, диффузию и проницаемость газа в угольной породе, а затем влияет на извлечение газа из угольных пластов [20–23].Деформация нестабильности ствола скважины также влияет на дренаж газа. Большинство газоотводных скважин в угольном пласте может пробурить более 200 метров, а длина уплотнения обычно составляет 10-15 метров, а длина камеры отбора газа составляет более 185 метров. Обрушение стенки ствола скважины в любой части 100-метровой скважины приведет к уменьшению ограниченной длины ствола скважины и снижению фактического коэффициента использования газа. Скважина, особенно в пласте мягкого угля с высоким содержанием газа и низкой проницаемостью, часто забрасывается из-за обрушения и закупорки определенной скважины, в результате чего угольный пласт имеет незаполненную зону для добычи газа, что приводит к потенциальному образованию угля и выброс газа [24, 25].Глубина разработки угольных шахт в Китае увеличивается со скоростью 8–12 м в год и, по оценкам, достигнет 1000-1500 м в следующие 20 лет. Окружающая горная порода проезжая часть деформируется с большой скоростью. Все более серьезные обрушения и деформации ствола скважины затрудняют отвод газа и выдвигают более высокие требования [26, 27].

Запасы мощных и ультратонких угольных пластов составляют более 45% от общих запасов угля моей страны. В будущем это станет важным направлением развития угольной промышленности Китая.С точки зрения добычи угля толщину выработанного угольного пласта можно разделить на 5 уровней мощности, из которых толщина угля превышает 8 м, что называется сверхтолстым углем. Угольный пласт 8 # шахты Баодэ расположен над песчаником S3 на дне формации Шаньси (P1S). Мощность угля колеблется от 2,15 до 10,50 м, в среднем 7,36 м. Максимальная мощность чистого угля 9,20 м; относится к угольным пластам от толстых до сверхтолстых. На руднике Баоде длина уплотнения, используемого при бурении пластов, составляет 0–8 м в соответствии с требованиями штата.Концентрация добычи низкая, что не способствует безопасному производству рудника Баоде. Чтобы решить проблему низкой скорости дренирования газа на шахте Баоде, компания также обеспечивает техническую поддержку обработки газа в других толстых сверхтолстых угольных пластах. Мы применили комбинацию теоретического моделирования и полевых экспериментов, чтобы выяснить ключевые положения герметизирующих отверстий в руднике Баоде и повысить эффективность герметизации. Предыдущие исследования были сосредоточены на влиянии расстояния между стволами [28], длины ствола [29] и времени ствола скважины [30] на эффект дренажа, а влияние положения герметизирующего отверстия на ствол скважины изучается редко.К тому же условия отработки угольных пластов в Китае совсем другие. Необходимо изучить зону уплотнения газоотводной скважины конкретной угольной шахты [31]. Чтобы полностью раскрыть эффект дренажа газоотводной системы, в этом исследовании, основанном на условиях угольных месторождений и условиях добычи угольной шахты Баоде, была предложена концепция ключевых положений герметизации ствола скважины, проанализировано распределение угольных стенок. трещины и зона закона утечки и фильтрации газа вокруг ствола скважины, а также предлагаемый план испытаний герметичности для различных зон герметизации.И было точно определено положение утечки газа, чтобы закрыть отверстие. Полевые испытания были проведены в возвратном воздуховоде 81310 угольной шахты Баоде, и были проанализированы законы изменения концентрации извлечения и чистоты газа в скважине для извлечения в различных областях уплотнения. Путем сравнительного анализа была получена оптимальная площадь уплотнения скважины для предварительного обезвоживания газа на угольной шахте Баоде, что не только снижает затраты, но и улучшает концентрацию бурения.

2.Профиль проекта

Район исследования представляет собой возвратный воздуховод угольной панели 81310 в третьей панели угольной шахты Баоде. Крупномасштабных разломов, складок и обрушительных колонн не обнаружено. Угольный пласт 8 # расположен над песчаником S3 на дне формации Шаньси (P1S), а мощность угля варьируется от 2,15 до 10,50 м, в среднем 7,36 м. Мощность чистого угля 1,85–9,20 м, в среднем 6,02 м; это угольные пласты от толстых до сверхтолстых, в основном толстые угольные пласты.Структура угольного пласта сложная, содержит 0 ~ 8 слоев пустой породы, а общая толщина пустой породы составляет 0 ~ 3,84 м, в среднем 1,38 м. Непосредственная кровля угольного пласта в основном состоит из песчанистых аргиллитов и аргиллитов, а часть — из крупного песчаника. Пол в основном состоит из аргиллита, за которым следует алевролит. Коэффициент вариации толщины угольного пласта № 8 составляет 27,5%. Основной угольный пласт включает толстый угольный пласт и очень толстый угольный пласт и постепенно становится толще с востока на запад. Угольный пласт повышенной толщины расположен на северо-западе и юго-востоке района добычи, а пласт угля средней мощности — на северной границе района добычи.

3. Принцип высокоэффективной герметизации скважины
3.1. Распределение поля трещин вокруг скважины

Более длительное время экстракции обычно приводит к снижению концентрации газа и плохой герметичности, поскольку плохой эффект уплотнения позволяет воздуху проезжей части попасть в скважину для добычи. Помимо нестандартной работы процесса герметизации, сломанная угольная стенка проезжей части и круг утечки вокруг скважины также приводят к попаданию воздуха в проезжую часть [32].Во время выемки проезжей части угольная стена с обеих сторон проезжей части подвергается воздействию горных работ, в результате чего образуются трещины и каналы утечки воздуха. Под действием разрежения воздух в проезжей части попадает в скважину. Под воздействием вибрации в процессе бурения угольный пласт также будет деформироваться и разрушаться, в результате чего образуются трещины и свободные зоны, которые из-за кольцевой формы называются «кругами утечки воздуха» [33–35], как показано на Рисунке 1. • Свободная зона приводит к плохому уплотнению.


3.2. Закон об утечке газа из скважины

Поскольку скважина угольного пласта строится на стороне проезжей части, на характеристики утечки и фильтрации газа из скважины неизбежно влияют изменения напряжения вокруг проезжей части [36]. Из рисунка 2 видно, что трехмерные напряжения (,,) на стене проезжей части снимаются в разной степени. По мере увеличения расстояния от стены проезжей части постепенно достигает исходного значения напряжения и сначала испытывает концентрацию напряжения, а затем постепенно возвращается к исходному значению напряжения.Концентрация напряжений намного выше, чем у. В соответствии с различными состояниями сброса давления, и окружение проезжей части можно разделить на четыре различных области напряжений (с I по IV). В области I,, и все снимаются, и каждое напряжение достигает минимума. В областях II и III и постоянно увеличиваются и испытывают большую концентрацию напряжений, пиковое значение которой в 1,3 раза превышает исходное значение напряжения. В области напряжения IV трехмерное напряжение приближается к исходному напряжению.


Четыре области утечки воздуха показаны на Рисунке 3. В области напряжений I перераспределение напряжений, вызванное выемкой проезжей части дороги, вызывает сильное снятие напряжения, и все раскрытия трещин увеличиваются. Проницаемость этой зоны наибольшая, и воздух легко проникает в скважину через окружающие трещины. Зона напряжения I — это зона свободной утечки воздуха (FAA). В области напряжения II, за исключением того, что два концентрированных напряжения с обеих сторон и на верхней и нижней сторонах приводят к уменьшению проницаемости вокруг ствола скважины, и вокруг ствола скважины, которые почти эффективно снимаются.Область напряжения II, вероятно, будет иметь утечку воздуха и может быть определена как область полусвободной утечки воздуха (SAA). Из-за высокого напряжения сжатия в SAA и закрытия трещин серьезность утечки воздуха в SAA ниже, чем в FAA. В зоне напряжений III и увеличиваются после выемки проезжей части, при этом незначительно высвобождается. Три напряжения вокруг ствола скважины обычно велики, особенно на верхней и нижней сторонах ствола скважины, а также на левой и правой сторонах. Напряженная зона III почти не имеет утечки воздуха и может быть описана как зона жесткой утечки воздуха (HAA).В зоне напряжений IV угольный пласт не подвергается выемке проезжей части. Из-за небольшого диаметра ствола скважины изменения, и, вызванные стволом скважины, относительно ограничены. Распределение напряжений в этой области очень близко к исходному напряжению, а проницаемость угля почти на исходном уровне и выше, чем у HAA. Зона напряжения IV может быть названа исходной зоной утечки воздуха (VAA). Поскольку VAA находится далеко от вентиляционной проезжей части, утечка воздуха из-за перепада давления слабее, чем в регионах I – III.


Поскольку FAA и SAA имеют более высокую проницаемость, чем две другие области, и примыкают к проезжей части, там с большей вероятностью произойдет утечка газа. Секция уплотнения должна превышать FAA и SAA (длина около 8 м), чтобы образовалась герметичная зона, состоящая из секций HAA (длина 8 м) для эффективного предотвращения утечки воздуха. В этом случае просочившийся воздух не может попасть в ствол скважины через трещины в участках FAA, SAA и HAA, а из-за низкого значения проницаемости HAA только несколько утечек воздуха попадают в ствол скважины в зоне VAA, как показано синяя стрелка.Следовательно, положение уплотнения 8–16 м обычно может обеспечить эффективную добычу газа на руднике Баоде.

3.3. Моделирование различных положений уплотнения в скважине
3.3.1. Управляющее уравнение транспортировки газа

Угольные трещины разделяют уголь на матричные блоки, а адсорбированный газ в угольной матрице действует как источник газа, постоянно пополняя газ, который уменьшается при откачке. В этой статье поток газа упрощается до последовательного процесса и рассматривается только изменение проницаемости трещин: где представляет собой скорость массообмена на единицу объема угольной матрицы и системы трещин, является форм-фактором матрицы, обозначает коэффициент диффузии газа, является газом. концентрация в угольной матрице, — это концентрация газа в системе угольных трещин, — это время адсорбции, полученное из сохранения массы: где — общая масса газа в угольной матрице на единицу объема, — это молекулярная масса газа, — универсальный газ постоянная, — температура угольного пласта.Общая масса газа в угольной матрице на единицу объема: где — плотность газа при стандартных условиях, — ложная плотность угля, — постоянная объема Ленгмюра и — постоянная давления Ленгмюра. Плотность газа

Подставляя формулы (3) и (4) в формулу (2), получаем

3.3.2. Начальные условия и граничные условия

Для уравнения деформации угля граничные условия смещения и напряжения могут быть определены как

Начальные условия потока газа могут быть выражены следующим образом: где представляет собой начальное давление газа в матрице и представляет собой начальное давление газа в трещине.

Рассчитан процесс газового потока в процессе отвода газа, и коэффициент уравнения в частных производных равен

Приведите формулу (5) в формулу (8),

Принимая фактическое положение верхней части проезжей части на третьей панели 81310 шахты Шэньхуа Шендонг Баоде в качестве фона, модель отвода газа вдоль залегающей длинной скважины создается в соответствии с местными параметрами с помощью программного обеспечения для моделирования Comsol, как показано на рисунке 4. Длина и ширина модели составляют 260 м и 150 м, соответственно.Давление газа в угольном теле составляет 2,5 МПа, давление всасывания — 13 кПа, проницаемость — 3,85 мД. Объект моделирования — группа из 10 параллельных скважин, которые строятся в угольной панели 81310 вдоль желоба. Длина скважины 200 м, шаг скважин 10 м. При одинаковом времени добычи, отрицательном давлении, расстоянии между скважинами, длине скважины, проницаемости для угля и давлении газа влияние различной длины уплотнения на добычу газа моделируется и анализируется.


При выемке проезжей части угольного пласта нарушается равновесное состояние давления газа в угольном пласте и давления матричного газа. Разрыв газа в зоне сброса давления постепенно фонтанирует в проезжую часть, и давление газа в угольном пласте перераспределяется, образуя зону выброса природного газа проезжей части. Зона выброса природного газа проезжей части угольного пласта существенно влияет на дренаж газа угольного пласта вдоль ствола скважины.На рис. 5 показано распределение давления газа на трех участках закупорки (8 м, 12 м и 16 м) после 800 дней дренирования. Видно, что по мере увеличения длины уплотнения ствола скважины объем влияния дренажа постепенно увеличивается, и давление газа быстро падает. Длину уплотнения можно определить в соответствии с реальной ситуацией в сочетании с эффектом извлечения и факторами стоимости.


4. Полевые испытания
4.1. Схема испытаний

Скважины были построены в №81310 возвратный воздуховод. В каждой группе было построено по 5 скважин с шагом 5 м, шаг скважин по каждой группе 20 м. Принципиальная схема компоновки буровой установки представлена ​​на рисунке 6. По таким параметрам, как коэффициент проницаемости угольного пласта, учитывалось влияние определенных трещин. При герметизации газодренажной скважины применялся метод герметизации «мешок типа два, один закачка» [37]. В положении уплотнения приняты положения уплотнения 0–8 м, 0–12 м, 8–16 м и 0–16 м, которые соответствуют первой группе, второй группе, третьей группе и четвертой группе на Рисунке 6. , соответственно.Испытания на герметичность проводились с этими комбинациями, и контролировались концентрация газа и поток чистого газа для каждого метода герметизации. Путем анализа и сравнения данных бурения была определена оптимальная зона уплотнения.


4.2. Результаты и анализ испытаний

В соответствии с данными испытаний проанализируйте график концентрации газа (Рис. 7) и кривую потока чистого газа (Рис. 8) во времени после четырех наборов скважин.



4.2.1. Концентрация смешанного газа

Из рисунка 7 видно, что во время дренажа средняя концентрация газа в четырех группах скважин составляет 48,7%, 39,32%, 63,57% и 58,37% соответственно. Концентрация смешанного газа третьей группы в 1,31 раза больше, чем в первой группе, в 1,62 раза больше, чем во второй группе, и в 1,09 раза больше, чем в четвертой группе. Кроме того, концентрация смешанного газа во всех четырех группах имеет тенденцию к снижению. Также видно, что концентрация смешанного газа третьей группы падает с 93% до 56.4%, но при этом сохраняется более высокая концентрация. Концентрация смешанного газа в трех других группах значительно снижается. При экстракции концентрация смешанного газа в первой, второй и четвертой группах снижается на 45,6%, 46,4% и 63% соответственно.

Обнаружено, что концентрация смешанного газа в первой и второй группах быстро снижается и не может поддерживаться на высоком уровне, что свидетельствует о негерметичности скважин в зоне уплотнения 0–8 м и 0–12 м. очень серьезно.Концентрация смешанного газа четвертой группы выше, чем у первой группы и второй группы, что указывает на то, что пористость в области уплотнения 0–16 м ниже, чем в области 0–8 м и 0–12. м. Область уплотнения 8–16 м имеет самую высокую концентрацию смешанного газа, что доказывает, что поры в этом интервале не развиваются, и эта область подходит для уплотнения.

4.2.2. Поток чистого газа

Из рисунка 8 видно, что во время дренажа поток чистого газа четырех групп равен 0.2106 м 3 / мин, 0,2361 м 3 / мин, 0,408 м3 / мин и 0,226 м 3 / мин. Поток чистого газа первой группы, второй группы и четвертой группы составляет всего 51,62%, 57,87% и 55,39% от третьей группы и, в свою очередь, увеличивается, указывая на то, что пористость скважин в области 0–8 м до 0–12 м, а затем до 0–16 м постепенно уменьшается.

Путем анализа концентрации газа и скаляра газа в четырех группах тестовых предварительных дренажных скважин в обратном дыхательном пути 81310 шахты Баоде было обнаружено, что рыхлая зона сильно влияет на поток газа в предварительных дренажных скважинах.По сравнению с национальным стандартом и положением уплотнения 0–8 м, используемым на руднике Баоде, положение уплотнения 8–16 м имеет более высокую концентрацию и чистоту газа, более медленное затухание и более длительный срок службы ствола скважины и больше подходит для уплотнения.

5. Выводы
(1) Согласно исследованию распределения трещин вокруг скважин на рабочем забое 81310, закон утечки газа был изучен с помощью численного моделирования COMSOL. Когда глубина уплотнения находилась в пределах зоны сброса давления, но за пределами «непроникающей зоны между трещиной и свободной поверхностью», насосный эффект был лучше, и стабильность секции уплотнения ствола скважины была лучше.Оптимальный диапазон герметизации дренажной скважины в испытательной зоне был определен как 8–16 м. (2) В ходе полевых испытаний и изучения ключевого положения герметизации скважины на руднике Баоде, правила изменения концентрации извлекаемого газа и чистого газа флюс в различных положениях уплотнительных отверстий. Было обнаружено, что когда положение уплотнения скважины для отбора газа в соседнем слое рудника Баоде составляло 8–16 м, средняя извлекаемая концентрация чистого газа составляла 63,57%, а средний поток чистого газа составлял 0.408 м 3 / мин. По сравнению с существующим положением уплотнения 0–8 м, степень уменьшения концентрации и скалярного количества извлекаемого газа является наименьшей, и достигается лучший эффект уплотнения. Таким образом, определено, что наилучшее положение для уплотнения угольного пласта в шахте Баоде составляет 8–16 м. (3) С помощью теоретического анализа и численного моделирования влияние различных положений уплотнения на влияние скважинного газа получается дренаж. Полевые испытания доказывают, что диапазон герметизации 8–16 м играет решающую роль в герметизации скважин на угольной шахте Баоде и обеспечивает теоретическую и техническую поддержку для определения надежных параметров дренажа.
Доступность данных

Данные, использованные для подтверждения результатов этого исследования, можно получить у соответствующего автора по запросу.

Конфликт интересов

Авторы заявили об отсутствии конфликта интересов в отношении исследования, авторства и / или публикации этой статьи.

Вклад авторов

Все авторы внесли свой вклад в эту статью. Синь Го подготовил и отредактировал рукопись. Синь Го и Шэн Сюэ внесли существенный вклад в анализ данных и отредактировали статью.Синь Го, Линьфан Се и Яобинь Ли просмотрели рукопись и обработали расследование в процессе исследования. Шэн Сюэ и Чуньшань Чжэн оказали финансовую поддержку.

Благодарности

Авторы выражают признательность за финансовую поддержку этой работы, оказанную Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (2018YFC0808000), Национальным фондом естественных наук Китая (513), Программой поддержки молодежных научных и технологических талантов (2020) Ассоциация науки и технологий Аньхой (RCTJ202005) и Открытый исследовательский фонд Государственной ключевой лаборатории угольных ресурсов и безопасной добычи полезных ископаемых, CUMT (SKLCRSM20KF003).

Детали для кемпинга и пеших прогулок Прочная лента для герметизации швов шириной 20 м и 20 мм для водонепроницаемых тканей с полиуретановым покрытием, спортивных товаров

Информация для кемпинга и пеших прогулок Подробнее о герметизации швов шириной 20 м и 20 мм Прочная лента для водонепроницаемых тканей с полиуретановым покрытием Спортивные товары
  1. Дом
  2. Спортивные товары
  3. Спорт на открытом воздухе
  4. Кемпинг и пеший туризм
  5. Другой кемпинг и туризм
  6. Подробная информация о эластичной ленте шириной 20 м и шириной 20 мм для водонепроницаемой ткани с полиуретановым покрытием

Прочная лента шириной 20 мм для герметизации шва Водонепроницаемые детали ткани с полиуретановым покрытием, защитная одежда, палатки, чехлы, навесы и т. Д., 1 шт. Герметизирующая лента для швов, для герметизации сшитых швов: ремонт дышащей водонепроницаемой ткани с полиуретановым (ПУ) покрытием: водонепроницаемая одежда для отдыха, спортивная одежда, униформа, предоставление новейших продуктов, Рекламные скидки, быстрая бесплатная доставка и круглосуточная поддержка.Подробная информация о эластичной ленте шириной 20 м и шириной 20 мм для водонепроницаемой ткани с полиуретановым покрытием. Подробная информация о эластичной ленте шириной 20 м и шириной 20 мм для водонепроницаемой ткани с полиуретановым покрытием.





Если применима упаковка, неповрежденный товар в оригинальной упаковке. См. Список продавца для получения полной информации. Измененный элемент:: Нет: Цвет: Белый. крышки, такие как коробка без надписи или полиэтиленовый пакет, Товар не для отечественного производства:: Нет: Страна / регион производства:: Китай.PU, UPC:: Не применяется: ISBN:: Не применяется, См. Все определения условий: Торговая марка:: Без торговой марки. Подтип:: Ткани с полиуретановым покрытием: Индивидуальный комплект:: Нет, защитная одежда, дышащая водонепроницаемая ткань с покрытием: водонепроницаемые материалы для отдыха. униформа, 1 шт. герметизирующая лента для швов, за исключением случаев, когда товар изготовлен вручную или не был упакован производителем в нерызничную упаковку. Тип:: Утюг на нашивке: MPN:: Не применяется, палатки, неиспользованные, шириной 20–20 мм, герметизирующая эластичная лента для водонепроницаемой ткани с полиуретановым покрытием. Для герметизации прошитых швов: ремонт на полиуретане.Упаковка должна быть такой же, как в розничном магазине, Состояние :: Новое: Совершенно новое, маркизы и т. Д., Неоткрытые, спортивная одежда, EAN:: Не применяется, Единица продажи:: Единица: Материал:: Клейкая лента .

Добро пожаловать в Town Hub .

или

Для более быстрого входа или регистрации используйте свою учетную запись в социальной сети.

[fbl_login_button redirect = «» hide_if_logged = «» size = «large» type = «continue_with» show_face = «true»]

Подробная информация о эластичной ленте шириной 20 м и шириной 20 мм для водонепроницаемой ткани с полиуретановым покрытием

Crossfit Grip 3 отверстия Кожаные кожаные перчатки для рук с регулируемой опорой для запястья, карбоновое сопротивление Shimano BIOMASTER 1000FB 1000S 2000S 2500S C2000 C2000HGS C2000S, Подробная информация о рыболовных вертлюгах на шарикоподшипниках 50 шт. Ксеноновые фары рабочего освещения для внедорожников, 2.50 1.50 2.00 Бифокальные спортивные солнцезащитные очки с закругленными краями Солнцезащитные очки для чтения 3.00. Патч 2×3 «Tan. Coyote Tan Кобура Kydex Light Bearing для Glock 41 Streamlight TLR1 / TLR-1 HL. Подходит для T / C Traditions Dixie и т. Д.» Drop-In «для дульных заряжателей .45 и выше. BLADE COVER Travel Sup Accessories Защитный шлем для бокса Защитное снаряжение для тренировок MMA Kickboxing, Confidence Электрическая беговая дорожка TP-1 Складная моторизованная беговая дорожка Белый KENDA KALIENTE K925 700X23C L3R PRO TIRE NEW 212112.Chiave Eleven Estrattore BB SHIMANO / НИЖНИЙ КРОНШТЕЙН BB SHIMANO, 18 в 1 Многофункциональный брелок EDC Snowflake для кемпинга на открытом воздухе, журнальный чехол для Ruger Comp 9 мм 40 45 NEW Barsony Black Leather IWB Holster, poc octal x Helmet, Airsoft 20 pack Стрельба по мишеням COWBOY WESTERN 11 «x17» для BB Gun.

Подробная информация о эластичной ленте шириной 20 м и шириной 20 мм для водонепроницаемой ткани с полиуретановым покрытием


musicamaestroradio.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.